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    分析为何细胞状态差

    发布时间: 2021-07-12  点击次数: 409次

    细胞状态很差,常常出现的现象是:细胞边缘不清晰、细胞不饱满、折光性差、背景比较脏、黑点很多、细胞碎片多(细胞凋亡后的细胞碎片)、单个细胞内有空泡(凋亡)且空泡比较多;如果细胞出现老化,也就是细胞比较扁平、增殖减缓、细胞核体积增大、细胞突触变多,此时观察到的细胞状态也是不正常的。

    ▲ 图1:背景很脏;

    ▲图2:有较多小黑点

    因此细胞状态差只是对这些现象的一种笼统说法。

    究其根本,细胞状态变差主要是由于两种原因:

    1 细胞营养条件不够

    2 细胞被污染了

    今天我们将深入分析影响细胞状态的这些原因。

    一、营养条件不够

    细胞营养条件不够时,就需要从培养基方面考虑。

    (1)血清

    由于血清来源于动物,且含有细胞培养中所需的各种营养(血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等),这奠定了血清是细胞培养实验中最基础普遍的试剂的基础。

    市面上的牛血清产品名称虽然五花八门,但根据其不同的特性,追其根本,大致可分为以下四种。根据牛的取血年龄可以区分:

    胎牛血清(Foetal Bovine Serum,简称FBS)指的是取自未出生,母牛剖腹心脏穿刺采血得来的血清。

    国产胎牛血清(并无明确定义,但通常用此命名)指的是出生4-6小时,且未进行哺乳(unsuckled)进食的新生牛,有时还称作国产新生牛血清。 

    新生牛血清(Newborn Calf Serum,简称NBCS,或称小牛血清)指的是出生14天-3个月进行取血的牛血清。

    成年牛血清(Adult Bovine Serum,简称ABS)指的是取血时牛龄通常超过12个月的牛血清。

    以上取血牛龄的差异主要是受当地国家畜牧业的发展及法规限制影响,因为牛血多为畜牧业副产业,并未有专门为取血而养的牛。

    这几种不同牛龄血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。常规来说,牛龄越小的牛血清,细胞培养效果越好。但是也需要根据自己培养的细胞类型来选择最合适的血清。

    同一血清不同批号内的成分和营养组成比例会不同,因为血清来源于动物,其组成成分有1000种左右,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。每个批号的组分和百分比含量都是不固定的,所以批间差异是存在的。因此在实验过程中,需要经过测试来找寻合适的血清批次。当实验需要更换血清时,细胞需要有一段适应期。因此,要根据自己的细胞种类进行合适的选择。

    (2)基础培养基

    培养细胞时,除了血清还需要添加基础培养基,混合成为完全培养基,基础培养基是成分确定且知其确切含量的,可以补充血清中缺乏的营养元素,基础培养基一般含有氨基酸、无机盐、维生素、含碳物质,蛋白和其他营养元素,每种成分对于细胞存活、代谢等功能都有不同影响,不同细胞系需要的成分含量也不同,因此市面上会存在各类培养基配方,如DMEM,RPMI-1640,M-199,MEM等,基础培养基也需要根据自己培养的细胞种类进行更合适的选择。自行配制基础培养基时,需要注意是否需另外添加营养物或必需物至培养基中(如:碳酸氢钠)并调整pH值。使用不适合的培养基培养细胞,细胞仍可生长但特性会改变。培养基中常用的酚红(pH指示剂)本身有微弱雌激素作用,会刺激具有雌激素受器的细胞生长。

    如果您都是按照操规范保存培养基和培养细胞,那么我们继续考虑污染情况。

    二、细胞被污染

    污染情况通常从以下几部分考虑。

    通常微生物污染也叫做外源污染,如:真菌、酵母菌、细菌、支原体、黑胶虫、病毒、细胞交叉污染等。

    这些污染都是有其自有特征的噢~

    (1)真菌污染

    这类微生物外观类似棉絮状的漂浮物,在显微镜下可观察到菌丝体,污染早期不会使培养基变黄。

    (2)酵母菌污染

    显微镜下常见成串的珠状物形态呈卵形,大约比细胞小5~10倍,当其进行出芽生殖时,会聚集成连体结构;爆发污染严重时,会造成培养基pH值改变,不易除去。

    (3)细菌污染

    培养基在短时间内变成黄色或白色浑浊,细胞停止生长甚至死亡;有些状况下培养基颜色改变不明显但细胞形态会变异(出现多角,多核状况)、细胞不附着,显微镜观察背景有大量黑点。

    (4)支原体污染

    支原体种类较多,常以寄生或腐生营养方式生长,广泛存在于环境之中,是细胞培养过程常见污染,经常来源于实验人员(支原体常见于人体皮肤、呼吸道、生殖道和消化道)、动物源血清及胰酶、消毒不完全的器具,大小只有0.15~0.3μm,所以能通过一般标准的细胞培养过滤方法,0.22μm过滤膜。支原体增长速度相较于细菌比较缓慢,污染初期(轻微)培养基可能依然清澈不会变黄,所以轻微污染时不容易用常规方法发现(细胞外观观察或是DNA染色法)确认。

           

    ▲ 左图:感染前;                                                ▲ 右图:感染后

    支原体污染不但会缓慢改变细胞形态、增殖、基因表达、蛋白合成及代谢反应,它携带的DNA/RNA与蛋白更可能造成QPCR、Western Blot或外泌体实验结果偏差。

    (5)黑胶虫污染

    目前科学界对黑胶虫并无定论,认为是不明沉淀现象或多种未知生物污染现象的通称。在高倍率显微镜头下,可观察到各式形状的小黑点(卵圆状、球状、杆状等)、活跃的布朗运动及明显游动现象,部分黑胶虫具有细胞毒性,可引起细胞生长迟缓或裂解凋亡。

    ▲ 黑胶虫污染

    (6)病毒污染

    病毒感染可能来自宿主动物细胞或病人,病毒感染及传播具有细胞专一性,在细胞培养污染物中是相对较难检测的。然而一旦细胞遭受污染后显微镜下能明显观察到细胞碎片增多、肿大、圆缩、脱落等病态变形,严重时会在单层细胞上观察到局部破损空斑。

                

    ▲ 左图:Before infection;右图:After 24 hours infectiond

    (7)细胞交叉污染

    曾有文献报道统计,目前使用的细胞株大约有15~20%不是科学家们所认为的细胞,而在生物医药领域中,细胞来源和细胞株身份鉴定检测观念普遍缺乏。细胞株的交叉污染,常在不经意的实验疏失(不同细胞株分盘时,共享一瓶培养基、枪头、移液管忘记更换,而造成不同细胞株之间的混合污染,或是实验操作人员录入错误细胞株名称,继代时的培养皿,冷冻细胞时的冻存管)中发生,而造成错误后续数据搜集;目前大部分的科学期刊都已有“细胞相关实验论文发表前,均需附上细胞鉴定报告”的规定(可查阅:文章发表前要求提供细胞鉴定的杂志),以此保证数据来源的正确性。

    目前常用的细胞身份验证的方式包括:短串联重复序列(STR)、同功酶分析、染色体组分型、扩增片段长度多态性(AFLP)的特征分析等方法。其中STR,是目前国际细胞库(包括:ATCC、DSMZ或是JCRB)常用于细胞株身份鉴定方法。

     

    三、细胞老化了

    无论是原代细胞或是细胞株,在细胞培养过程中细胞老化现象是存在且常见的,但却容易被操作人员忽略,老化的细胞会出现特征包括:细胞增殖变慢、细胞核体积异常及多核(4-8核)、表面分泌物增多、细胞体积增大、细胞扁平、细胞质中出现空泡等现象。

    老化细胞不会立即死亡,但其基因表达会发生变化,如果细胞老化现象严重,建议从种子库或工作库重新复苏细胞。

    图1: 实心箭头指示的是发生细胞老化的HEK293细胞,SA-β-gal染色阳性,而空心箭头指的是未发生老化的细胞。

    图2: 被染上蓝色的是发生老化的MSC细胞, 未被染色的是未发生老化的细胞。

    由图片可以看出老化细胞体积增大、细胞扁平。

     

    分析了这么多~

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