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    分享哺乳动物细胞培养的9个基本技巧!

    发布时间: 2021-09-22  点击次数: 723次

    一、净化空气

    在开始任何组织培养工作之前,打开新风系统至少15分钟,确保有清洁的空气流入。要始终确保没有任何东西覆盖它。每周打开紫外线灯3-4次,最多半个小时,可以帮助保持你的实验室无污染,但你应该记住,紫外线只会杀死它直接照射到的微生物。紫外线照射对眼睛和皮肤也是有害的,所以在使用遮光罩时,请保持光线关闭。在工作前后用消毒剂擦拭超净台(大多数人使用70%的乙醇,但你也可以使用Incidin湿巾)。


    二、远离污染物

    虽然你很可能是实验的主要污染源,但是你完全有必须要采取你所及的的预防措施,防止细胞受到污染。用70%乙醇擦拭实验室的所有东西,包括你戴手套的手!你还应该在开始之前把所有的珠宝和你戴的手表都取下来。此外,避免不必要的交谈,因为交谈会产生微生物气溶胶,可能会进入超净台。在进入实验室前彻底计划你的实验是另一个防止污染的好方法。这听起来很琐碎,但往往能在问题出现之前解决大多数问题。有了适当的计划,你就可以确切地知道你需要把什么材料带进实验室,并且可以带入之前把它们都擦干净。


    三、分装试剂,保持实验室整洁

    储物柜最好不要带护罩。杂乱无章不仅使你的工作区很难清洁干净,而且还会破坏工作区周围的层流气流。确保只将所需材料带入工作区域。这将给你足够的空间自由移动而不会造成泄漏。另外,当液体容器不能立即使用时,请将其盖紧。防止泄漏,但如果发生任何泄漏,应立即用70%乙醇擦拭。最后,避免将移液管直接插入培养基瓶中,而应先将溶液倒入一次性无菌管中,分装使用不但能方便管理更能避免出现大规模的污染。


    四、确保细胞不要离开培养箱太久

    当你准备东西的时候,确保你的细胞不会在外面呆太久。培养箱的舒适区通常在37度左右°5%的二氧化碳,温度突然变化(尤其是开空调的时候)会让细胞变得焦躁不安,所以把它们放在无菌培养箱中。这也意味着任何与细胞接触的培养基或洗涤缓冲液,如PBS(磷酸盐缓冲盐水),都应该在37°C.这也是大多数实验室都有一个37度的水浴目的。


    五、注意细胞的形状和大小

    你应该在超净台附近放一个光学显微镜,这样你可以定期观察你的细胞(在进入实验室之前和将它们放入培养箱时)。这也有助于熟悉你正在使用的细胞系的形态,以便识别交叉污染。即使某些哺乳动物细胞系具有相似的形态,但是观察细胞是否污染,显微镜一定不可少。


    六、合理的设置细胞传代

    不要偷懒于分割细胞,而要形成一个常规。对于大多数快速生长的细胞系(如HEK293,每16小时增殖一次),一周两次通常有效。例如,如果你在星期一将细胞稀释1:5进行传代,你应该可以在下一个星期四,或者最迟在星期五进行分裂。最好在细胞板80-85%汇合之前分裂细胞,因为细胞这个时候属于生长鼎盛期。如果它们达到汇合点,就会进入平顶期,它们就会停止生长(接触抑制),经过传代后需要时间才能恢复。这可能会改变它们的生长速率和形态,使得它们不适宜继续用于需要可复制结果的实验。大多数细胞培养基含有pH指示剂酚红(pH范围6.0(黄色)-8.0(红色))。血液pH值通常在7.35-7.4左右,因此哺乳动物细胞对pH值很敏感。橙色和浅橙色之间的颜色通常都表明细胞需要换液或者已经足够生长,通过分泌乳酸(细胞代谢的副产物,对细胞有毒)使周围的介质变酸,这个时候若细胞密度太大就选择传代。


    七、细胞状态就是力量!

    当用一个新的细胞系开始培养时,将细胞生长,将其等分成若干小瓶,冷冻,除一个外,其余全部储存在液氮中。冷冻的小瓶组成了你的主库存,而你可以用剩下的小瓶来生长和冷冻额外的细胞,这些细胞可以作为你的工作库存。这可以确保您有许多细胞储存在其原始状态,一旦工作细胞变得太老化或污染。您还有之前的库存细胞可以取代。这也确保了任何在实验室需要新细胞的人都可以带上一瓶“原始状态"的主库存,而不是“借用"已经经过多次传代并可能被污染的细胞。


    八、注意实验用的细胞代次

    注意传代次数。细胞在高传代数(>30-40倍)时会改变它们的生长速度和形态,这取决于细胞系,所以旧细胞应该退役!相反,第3-4代年轻的细胞太年轻,不应该在立即用于重要的转染实验。额外的传代可以让你的细胞获得稳定的生长速度。

    在你的盘子和/或烧瓶上贴上你的名字、日期、你使用的细胞系和它的通道号是一种很好的做法。特别是在一个多人从事不同工作的实验室里,这将有助于你避免意外混合造成交叉污染,也有助于你保持良好的实验记录。


    九、及时灭菌是细胞的狂欢!

    最后,但并非最不重要的一点是,任何用于再利用的实验室材料(例如,用于液体废物的巴斯德移液管)在每次使用前都应消毒。此外,所有受污染的液体和固体废物在处理前应进行高压灭菌。

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