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    干货分享:动物过继法去除支原体步骤

    发布时间: 2021-09-23  点击次数: 349次

    细胞长着长着然后越来越慢,然后随便你加什么它就在那里,不增不长,甚至还翻个白眼给你看,可能是支原体感染了 怎么办?

    可以试试动物过继法(可动物成瘤细胞的福音):

    1.取3只4-5周龄BALB/c裸鼠,每只于右侧腋下皮下接种可成瘤的细胞,待肿瘤平均体积长至约1.0 X 1.0X 1.0cm3时,得到荷瘤小鼠。将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%(体积百分比浓度)的乙醇水溶液中3-5 min,得到消毒后的小鼠;在超净工作台内,用无菌剪刀和无菌镊子从消毒后的小鼠胸口剪开小鼠皮肤,小心剥离得到肿瘤组织。

    用眼科剪稍微剪碎肿瘤组织(此时的肿瘤组织大小为0.5 X 0.5 X 0.5cm3),

    2.加0.01mol/L PBS中浸泡(使肿瘤组织完全浸润在0.01mol/L PBS中)2min后将其取出,得到浸泡后的肿瘤组织。用眼科剪在无菌平皿上充分剪碎浸泡后的肿瘤组织(此时的肿瘤组织大小为0.2X0.2X0.2mm3),在剪碎浸泡后的肿瘤组织的过程中适时滴加0.0 Imo I /L PBS,保持该肿瘤组织处于湿润状态,得到剪碎的肿瘤组织。向盛有剪碎的肿瘤组织的无菌平皿中滴加胶原酶I溶液,用I mL枪头吹散肿瘤组织(为了能更好的吹散细胞,建议把枪头剪掉3mm),得到胶原酶肿瘤组织混合物。

    3.把胶原酶肿瘤组织混合物转移到50mL离心管中,将盛有胶原酶1-肿瘤组织混合物的50mL离心管在震荡器上进行震荡3 min,得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物,将震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物在37°C水浴锅中孵育2 min,得到胶原酶消化后的肿瘤组织,然后离心洗涤

    离心洗涤操作步鄹如下:

    将孵育后的胶原酶消化后的肿瘤组织于300g下离心6 min,弃上清液,加入20 mL 0.01mol/L PBS,混勾后于300g下离心6 min,再弃上清液

    再加入20 mL 0.01mol/L PBS,混勾后于300g下离心6 min,弃上清液,反复三次得到胶原酶消化后的肿瘤组织。

    加入该细胞的完全培养基,在细胞培养箱中培养两天,细胞培养箱中CO2的体积百分比为6-8%,温度为35-38°C,得到组织结构松散的肿瘤组织,再在结构松散的肿瘤组织中加入胶原酶溶液进行消化。重复之前的离心操作步骤,

    向组织结构松散的肿瘤组织中加入胰酶溶液,得到胰酶-肿瘤组织混合物,将胰酶-肿瘤组织混合物在在超净工作台上常温静置1-3分钟后,加入双倍的胎牛血清FBS终止消化,倒掉胰酶肿瘤组织悬液,得到胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞。

    加入细胞完全培养基置于培养箱培养,传代后送STR检测,支原体检测,此操作可以去除大部分细胞的支原体污染并且可以提升细胞的活力。

    友情提示,不足1000个字的操作方法看起来简单,但是操作起来可能需要1-2个月的时间哦,另外原代肿瘤细胞的分离,此步骤也可参考。


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