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    DNA提取的8个问题解答

    发布时间: 2021-09-28  点击次数: 2593次

    质粒DNA的提取是DNA技术中的必需实验技能。分离质粒DNA一般分为三个步骤:

    1、培养细菌使质粒扩增

    2、收集和裂解细菌

    3、分离和纯化质粒


    DNA碱裂解法是较常用的提取的方法,在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒DNA链发生断裂。所以,多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒:共价闭合环状DNA(cccDNA):质粒的两条链没有断裂;超螺旋开环DNA(ocDNA)


    而在DNA提取中总会遇到各种一些问题,导致实验无从下手,下面我们来分析一些常见的问题:

    一、为什么用无水乙醇沉淀DNA?

    乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般实验的做法是:初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。


    二、在用无水乙醇沉淀DNA时,为什么一定要加NaAC或NaCL至最终浓度达0.1-0.25MOL/L?

    在Ph为8左右的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAC或NaCL,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,DNA沉淀不完全,反之DNA难以收集。在沉淀的DNA过程中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。


    三、为什么在保存或抽提DNA过程中,一般采用TE缓冲液?

    在基因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用,所以采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH /Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。加核糖核酸酶降解核糖核酸后,要用SDS与Kac来处理一次,可以让沉淀更加完全。


    四、如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?

    采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,而小分子所需PEG浓度在20%左右


    五、为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?

    在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容光焕发器数次,加入异戌醇能降低分子表面张力,减少在振荡时气泡的产生;配比一般是氯仿与异戌醇为24:1,也可以采用酚,抽提DNA去除蛋白质时,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用


    六、为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?

    因为酚与水有一定的互溶。苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中,不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失。用Tris调节至PH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。


    七、呈粉红色的酚可以使用吗?

    保存在冰箱中的酚,容易和空气中的氧气发生化学反应而变成粉红色的,这样的酚容易降解DNA,一般不可以使用


    八、怎么保存酚不被空气氧化?

    加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%。8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在一定程度上能抑制Dnase的活性。用Tris PH8.0水溶液饱和后的酚,最好分装在棕色小试剂瓶里,上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液,隔绝空气,也可以往瓶里充入氮气,防止与空气接触而被氧化。然后保存在4℃或-20℃冰箱中,可以保存几个月不会变色。


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