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    细胞培养无小事——细胞培养的主要步骤

    发布时间: 2021-09-29  点击次数: 463次

     一个小细胞可能会把人弄得吃不下,睡不着,焦头烂额???信不信还真的有这样的事情 ,可能整个实验下来计划是三个月左右,但实际有时候出手的第一步就遇到了拦路虎,why?细胞总是养不好;天啊,马上就到了三个月了,SO sad,下面我们就来看看细胞主要的培养步骤吧。


    选对培养基很重要:

    培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,一般首先选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养最好首先选的培养基。 

    GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

    GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

    酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

    培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

    丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。 

    一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 

    大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。这个特别在血清上体现的很明显,有些血清沉淀特别多,客服都会告诉您这个是血清的析出蛋白,让您不要离心直接使用也是这个原理 ,因为离心之后您的血清连那么点营养蛋白都没有啦 

    38 在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解,如果在室温下放置超过30分钟,就会变得不稳定 

    同时细胞的状态也非常重要,有些老师认为,肿瘤细胞反正可以无限传代,那么我就用之前传过188代的细胞来做实验又如何,要是细胞的形态好,可能真的没有什么问题,但是若细胞形态也不行,那要考虑是否用这个细胞了 ,一般细胞的形态不好涉及到三个方面:1.培养基使用的不对严重改变细胞的营养环境,细胞为自救不得不变异以求生长;2.操作手法不对,造成细胞污染等,3.传代次数太多,因为每次传代都会给细胞造成轻微的损伤,导致细胞在传代之后不断的修复,修复的细胞需要的衍生物,比如血清,培养基,可能会根据配方和批次的不同,给细胞造成不同程度的变异。

    So easy的操作手法:

    第一见细胞的时候,都不知道从何入手,太娇贵了 ,怎么办?其实,我们只要记住一点就可以了:无菌操作,无菌操作,无菌操作,重要的事情说三遍,之后我们就可以放开手脚,大干一场了。 

    Step 1 : 冷冻管应如何解冻?

    取出冷冻管后,须立即放入37 C水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。注意:复苏不一定要离心,除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可。

    如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 

    Step 2:怎么培养?

    培养关键点还在传代操作,一想到传代,天啊 ,会不会很复杂?首先我们要等到细胞到达80%-85%的密度再进行操作,为什么是这个密度?因为这个密度刚好是细胞生长的鼎盛期,因为细胞和细胞间都会有信号通路互相联系,这个时候他们都共同商量好了要努力生长,然后传代之后,他们看到空间还是这么大,就会把努力生长的精神一直传承下去,直到他们过了生长鼎盛期到生长平顶期为止。当然有些贪婪的聚集成簇生长的细胞,他们会不辞辛苦,日以继日的生长,直到培养基不能给他们提供一点养分为止。 

    Step 3:不可忽略的重要的传代过程:

    1.37度水浴加热完全培养基,0.25% 胰蛋白酶/EDTA溶液,我们不建议在37度温度下加热试剂和培养基,水浴优先使用。

    2. 用DPBS冲洗细胞,并倒掉洗过的DPBS。

    3. 加入1 ml 0.25% T/E溶液装入T-25瓶中。轻轻摇动烧瓶,以确保T/E溶液完全覆盖细胞。用显微镜观察细胞形态的变化。

    4.。在孵育期间,准备一个15毫升的锥形离心管与5ml胰酶中止液

    5.在消化时,轻轻敲打培养瓶的侧面,将细胞从表面剥离出来。在显微镜下检查,确保所有的细胞间隙变大并且都开始呈流沙状脱落。

    6.. 向培养瓶中加入5 ml胰酶中止液,将分离的细胞转移到15ml离心管中。用另外5 mll胰酶中止液清洗培养瓶以收集残留的细胞。

    7.将15毫升离心管以1000 rpm离心5分钟,收集消化好的细胞沉淀。

    8.将细胞沉淀分别滴入我们要分瓶的容器里,完成传代。



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