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    实时荧光定量PCR的优化(一)

    发布时间: 2021-10-12  点击次数: 385次
    如果是病毒定量和SNP基因分型的实时荧光定量PCR,我们需要尽可能高特异性;如果是病原体、mRNA检测,我们需要高灵敏度。


    想要提高PCR扩增效率、特异性及灵敏度,我们可以通过一系列措施优化实时荧光定量PCR实验。首先是靶序列的选择。


    1、选择的靶序列合适长度在50~150bp之间。较短的序列合成耗时短,扩增时间缩短,因此污染DNA被扩增的可能性降低。

    2、选择靶序列时,使用BLAST检索分析靶序列是否存在多态性和测序错误,并避开。如果靶序列中出现重复序列,会降低PCR检测灵敏度,也应该避开。

    3、控制靶序列中GC含量≤60%。高GC含量,会影响靶序列在热循环中的变性,也容易产生非特异性扩增。

    4、避免产生二级结构。靶序列如果有反向重复的序列,容易产生二级结构,影响引物、探针的杂交。

    除此以外,我们还需要保证模板的质量不会影响扩增,实时荧光PCR的结果才有可靠性。例如损伤的DNA在PCR中不能充分扩增,或者根本不能扩增。同时,如果模板中存在抑制DNA聚合酶的试剂(DMSO等)和污染物(SDS等),也会影响PCR的可靠性。



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