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    化学感受态细胞进行质粒DNA转化的原理

    发布时间: 2021-10-25  点击次数: 544次

    背景介绍





    将质粒DNA转化入细菌的过程称为转化

    转化通常有两种方法:化学转化法电穿孔法

    电穿孔法的转化率高达 109 ~ 1010个转化子/μg 质粒 DNA,转化率比化学转化法高,当可能得到的每一个克隆都非常重要时(如构建cDNA文库),就需要用电穿孔法。

    化学转化法一般每微克 DNA 能获得105 ~ 106个转化子,可满足常规的克隆实验需求,因此化学转化法在克隆实验中是较为常用到的转化方法。




    化学感受态细胞转化步骤




    化学转化法中用到的感受态细胞是化学感受态细胞,化学感受态细胞常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法来制备。

    化学感受态细胞转化的实验步骤可以简单分为以下4步:

    1、冰上融化感受态细胞,将DNA加入感受态细胞中,轻弹管壁混匀,冰上放置30 min

    2、42 ℃热激,冰上孵育2 min

    3、加入不含抗生素的LB培养基,37 ℃复苏

    4、离心后弃部分上清,重悬后涂板,过夜培养

    在化学转化法的实验步骤中,为何要冰上放置30 min、热激、冰上孵育2 min、加入不含抗生素的LB培养基在37 ℃复苏?每一步的作用及背后的原理是怎样的?


    要理解这些步骤的作用和背后的原理,我们首先要了解下化学转化法中DNA进入细胞需要克服哪些困难。







    DNA要进入细胞需要克服的困难

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    图1.DNA和细菌细胞膜的电荷排斥


    困难1:DNA带负电荷,细菌的细胞膜也带负电荷,需要克服DNA和细胞膜间的电荷排斥作用;

    困难2:DNA进入细胞需要细胞膜上有孔隙

    01

    克服电荷排斥

    化学感受态细胞转化的第一步,加入DNA后,轻弹管壁混匀,冰上静置,使Ca2+与DNA结合中和DNA的负电荷,Ca2+与细菌细胞膜结合中和电荷,克服了外来DNA和细菌细胞膜之间的负电荷排斥作用。Ca2+与DNA和细菌细胞膜脂多糖的磷酸盐形成配位络合物,Ca2+促进了DNA和脂多糖的结合。

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    图2.Ca2+克服了外来DNA和细菌细胞膜之间的负电荷排斥

    02

    孔隙的形成与消失

    化学感受态细胞转化的第二步是热激。热激使温度升高,细胞膜的脂质释放(图3-A),在细胞膜上形成孔隙(图4-E),DNA进入细菌内部。热激后在冰上冷却2 min,温度降低,细胞膜的蛋白质释放(图3-B),脂质占比增高,细胞膜的流动性升高,细胞膜上的孔隙消失(图4-F)。

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    图3. A:脂质释放曲线,B:蛋白质释放曲线

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    图4.感受态细胞在转化过程中表面形态的变化

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    抗性基因的表达

    化学感受态细胞转化的第三步,加入LB培养基,37 ℃复苏,该步骤的主要作用是使感受态细胞恢复生长,使感受态细胞中的质粒表达抗性基因,这样在涂板后带有目标质粒的大肠杆菌在相应抗性的平板上才能正常生长。

    综上,化学感受态细胞在转化过程中进行冰上放置是为了使DNA吸附到感受态细胞表面;热激步骤使感受态细胞表面形成孔洞,DNA进入感受态细胞内;冰上孵育使感受态细胞的孔洞消失;37 ℃复苏是为了是细胞恢复生长并表达抗性基因。 
    本期的克隆小讲堂之化学感受态细胞转化原理的介绍就到这里,下面为您推荐一波优质的化学感受态细胞产品,为您的研究添砖加瓦。



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    参考文献:

    1、Panja S, Saha S, Jana B, Basu T. Role of membrane potential on artificial transformation of E. coli with plasmid DNA. J Biotechnol. 2006 Dec 15;127(1):14-20. 

    2、Panja S, Aich P, Jana B, Basu T. How does plasmid DNA penetrate cell membranes in artificial transformation process of Escherichia coli? Mol Membr Biol. 2008 Aug;25(5):411-22. 

    3、Asif A, Mohsin H, Tanvir R, Rehman Y. Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation. Front Microbiol. 2017 Nov 7;8:2169.

    4、Lim Y, Su CH, Liao YC, Lee SY. Impedimetric analysis on the mass transfer properties of intact and competent E. coli cells. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2019 Jan;1861(1):9-16.



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