病原微生物提取的方法有哪些？

数据统计

据 WHO 统计，全球感染性疾病导致的患者死亡占全部死因的 25%以上，在中国，感染性疾病占所有疾病的 50%以上，75%造血系统肿瘤患者和 50%实体肿瘤患者死于感染，脓毒症（严重感染）患者病死率高达 50%。而在面对疑难重症时，快速检测病原微生物变得刻不容缓。

什么是病原微生物

病原微生物是指侵犯入人体引起感染的微生物，或称病原体。病原微生物包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫和朊毒体等。mNGS就是综合分析来自患者样本的病原微生物的基因物质（DNA和RNA），实现病原种属的快速鉴定和深入分析。mNGS检测技术由于通量高、快速、成本适宜、准确度高等特点，在感染性疾病领域应用愈发火热，同时也正在改变原有的检测手段，大大提高了危急重症和疑难感染的诊断水平。

为什么要去除宿主DNA

mNGS检测流程包括：临床评估、样本收集、保存和运输、核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析和出具报告几大步骤。多数临床标本存在大量宿主细胞和宿主游离核酸，微生物核酸丰度相对较低，有些样本中人源宿主DNA占比高达50-90%左右，这会导致后续测序数据中大部分是宿主DNA的信息，而病原微生物的数据占比较少，且宿主DNA 的非特异性序列还会干扰下游病原微生物的的判断。针对这一问题，通常在核酸提取环节时去除宿主DNA或者增加测数据量的方式来提高病原微生物的检出。接下来小编跟大家介绍几个去除宿主DNA的小妙招~

怎么去除宿主DNA

目前去除宿主DNA的方法主要分为提取DNA前去除和提取DNA后去除。提取DNA前去除包括物理法、生物法、化学法，而提取DNA后去除主要通过抗甲基化DNA磁珠来实现。

1.物理法

该方法基于宿主细胞和微生物细胞大小的差异去除宿主细胞，例如粘膜上皮细胞平均大小为50 μm，而一些典型的细菌细胞一般是1 μm。这种情况下可以采用过滤法去除宿主细胞，或者根据细胞沉降系数的差别，利用离心法去除宿主细胞。但是该种方法无法有效去除胞外DNA。

2.生物法

基于微生物和动物细胞结构的不同，选择性的裂解宿主细胞，利用核酸酶酶解掉释放出来的宿主DNA，后利用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物，最后纯化微生物DNA。或者也可以利用人源细胞的细胞膜较微生物外壁脆弱的特点，在核酸提取前用温和去污剂（如皂苷）裂解宿主细胞释放 DNA，再用DNaseⅠ酶解裸露的宿主DNA ，后续进行微生物DNA提取等操作。该种方法通常可使微生物富集效率提高1000倍[1]。

3.化学法

PMA（叠氮碘化丙锭）是一种可以高效结合dsDNA的染料，二者结合后荧光会增强，在可见光的诱导下，PMA分子的叠氮化物基团被光解并发生C-H插入反应并与DNA形成共价键，从而产生恒久性的DNA修饰，从而使DNA的片段化。由于这种染料无法通过功能完整的细胞膜，所以其可以标记裸露在外的DNA。该种方法先利用低渗溶液破坏人源宿主细胞，后利用PMA去除宿主DNA，后结合用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物，最后提取微生物DNA^[2]。

4.抗甲基化DNA磁珠

在原核生物中，DNA甲基化主要发生在腺嘌呤碱基（A）上，在真核生物中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶碱基（C）上，人类基因中有90%以上的CpG位点被甲基化修饰。该方法先提取全部的DNA，利用带有蛋白A修饰的磁珠，通过MBD2-Fc蛋白媒介，与宿主DNA中甲基化的CpG位点特异结合，可有效去除高达98%的甲基化宿主DNA，从而针对性的去除真核生物中常见的甲基化的核苷酸序列，可实现3~5倍富集^[3]。

如果某些微生物甲基化模式和宿主类似，在去除宿主DNA时也会被去除。

【参考文献】

[1] Charalampous T, Kay GL, Richardson H, et al. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection[J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(7): 783‐792. DOI:10.1038/s41587‐019‐0156‐5.

[2] Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, et al. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion [J]. Microbiome, 2018, 6(1): 42. DOI: 10.1186/ s40168‐018‐0426‐3.

[3] Miller S, Naccache SN, Samayoa E, et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid[J]. Genome Res, 2019, 29(5): 831‐842.DOI:10.1101/gr.238170.118.