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    病原微生物提取的方法有哪些?

    发布时间: 2021-10-25  点击次数: 642次

    数据统计

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    据 WHO 统计,全球感染性疾病导致的患者死亡占全部死因的 25%以上,在中国,感染性疾病占所有疾病的 50%以上,75%造血系统肿瘤患者和 50%实体肿瘤患者死于感染,脓毒症(严重感染)患者病死率高达 50%。而在面对疑难重症时,快速检测病原微生物变得刻不容缓。



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    什么是病原微生物

    病原微生物是指侵犯入人体引起感染的微生物,或称病原体。病原微生物包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫和朊毒体等。mNGS就是综合分析来自患者样本的病原微生物的基因物质(DNA和RNA),实现病原种属的快速鉴定和深入分析。mNGS检测技术由于通量高、快速、成本适宜、准确度高等特点,在感染性疾病领域应用愈发火热,同时也正在改变原有的检测手段,大大提高了危急重症和疑难感染的诊断水平。




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    为什么要去除宿主DNA

    mNGS检测流程包括:临床评估、样本收集、保存和运输、核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析和出具报告几大步骤。多数临床标本存在大量宿主细胞和宿主游离核酸,微生物核酸丰度相对较低,有些样本中人源宿主DNA占比高达50-90%左右,这会导致后续测序数据中大部分是宿主DNA的信息,而病原微生物的数据占比较少,且宿主DNA 的非特异性序列还会干扰下游病原微生物的的判断。针对这一问题,通常在核酸提取环节时去除宿主DNA或者增加测数据量的方式来提高病原微生物的检出。接下来小编跟大家介绍几个去除宿主DNA的小妙招~


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    怎么去除宿主DNA

    目前去除宿主DNA的方法主要分为提取DNA前去除和提取DNA后去除。提取DNA前去除包括物理法、生物法、化学法,而提取DNA后去除主要通过抗甲基化DNA磁珠来实现。


    1.物理法


    该方法基于宿主细胞和微生物细胞大小的差异去除宿主细胞,例如粘膜上皮细胞平均大小为50 μm,而一些典型的细菌细胞一般是1 μm。这种情况下可以采用过滤法去除宿主细胞,或者根据细胞沉降系数的差别,利用离心法去除宿主细胞。但是该种方法无法有效去除胞外DNA。


    2.生物法


    基于微生物和动物细胞结构的不同,选择性的裂解宿主细胞,利用核酸酶酶解掉释放出来的宿主DNA,后利用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物,最后纯化微生物DNA。或者也可以利用人源细胞的细胞膜较微生物外壁脆弱的特点,在核酸提取前用温和去污剂(如皂苷)裂解宿主细胞释放 DNA,再用DNaseⅠ酶解裸露的宿主DNA ,后续进行微生物DNA提取等操作。该种方法通常可使微生物富集效率提高1000倍[1]


    3.化学法


    PMA(叠氮碘化丙锭)是一种可以高效结合dsDNA的染料,二者结合后荧光会增强,在可见光的诱导下,PMA分子的叠氮化物基团被光解并发生C-H插入反应并与DNA形成共价键,从而产生恒久性的DNA修饰,从而使DNA的片段化。由于这种染料无法通过功能完整的细胞膜,所以其可以标记裸露在外的DNA。该种方法先利用低渗溶液破坏人源宿主细胞,后利用PMA去除宿主DNA,后结合用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物,最后提取微生物DNA[2]


    4.抗甲基化DNA磁珠


    在原核生物中,DNA甲基化主要发生在腺嘌呤碱基(A)上,在真核生物中,DNA甲基化主要发生在胞嘧啶碱基(C)上,人类基因中有90%以上的CpG位点被甲基化修饰。该方法先提取全部的DNA,利用带有蛋白A修饰的磁珠,通过MBD2-Fc蛋白媒介,与宿主DNA中甲基化的CpG位点特异结合,可有效去除高达98%的甲基化宿主DNA,从而针对性的去除真核生物中常见的甲基化的核苷酸序列,可实现3~5倍富集[3]

    如果某些微生物甲基化模式和宿主类似,在去除宿主DNA时也会被去除。


    【参考文献】

    [1] Charalampous T, Kay GL, Richardson H, et al. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection[J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(7): 783‐792. DOI:10.1038/s41587‐019‐0156‐5.

    [2] Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, et al. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion [J]. Microbiome, 2018, 6(1): 42. DOI: 10.1186/ s40168‐018‐0426‐3.

    [3] Miller S, Naccache SN, Samayoa E, et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid[J]. Genome Res, 2019, 29(5): 831‐842.DOI:10.1101/gr.238170.118.



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