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    MDCK细胞培养

    发布时间: 2021-10-29  点击次数: 356次
    简介


    一、目的
    MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员,必须按照本文件相关的操作规程进行操作。
    二、适用范围
    适用于疾控中心所有技术人员 。
    三、程序
    (一)生物安全要求
    实验室生物安全级别:BSL-1
    所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。



    材料与仪器


    二)材料
    1. 生长成片的MDCK细胞
    2. 无菌的T25细胞培养瓶
    3. D-MEM培养液(含有L-谷氨酰胺)
    4. 青、链霉素母液(10000 U/mL青霉素G;10000µg/mL硫酸链霉素),分装后保存于-20℃
    5. HEPES缓冲液,1M母液
    6. 胎牛血清
    7. EDTA -胰酶(0.05%胰酶,0.53mMEDTA-4Na),分装后保存于-20℃
    8. 7.5%牛血清白蛋白组分V
    9. 1mL、10mL无菌移液管
    10. 70%~75%的酒精
    注意事项:经常检查试剂使用的有效期。



    实验步骤


    (三)实验步骤
    这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例,叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变,MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
    1. D-MEM培养液的准备
    500mL D-MEM液中加入:
    青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素;100µg/mL链霉素),
    HEPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)。
    7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL
    2. 细胞生长液的准备
    胎牛血清10mL加到90mL的上述(1)的液体中,使胎牛血清的终浓度为10%。
    3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去,加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
    4. 温和地摇动细胞瓶1min,使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
    5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
    6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层,37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离(约5~10min)。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。
    7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液,轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
    8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液(细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞)
    9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL(6×105/mL)细胞悬液,剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2~3日可生长成片(80%~90%)的单层细胞。
    10. 于37℃,5%CO2培养箱里培养细胞,每天观察细胞状态,以供进一步实验用。



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