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做好流式太难？可能方法就用错了，解决思路看这里!
发布时间： 2021-11-02 点击次数： 1789次流式细胞术（FCM）是利用流式细胞仪对单个细胞或者生物微颗粒的生物学性质进行分析的检测方式。其特点是能够快速、精准的分析单个细胞的多种特性，适用于定性、定量分析细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分，还可以研究细胞的各种功能状态等，特别适用于大量样品的检测。
现已被广泛用于免疫学、细胞生物学、血液学、肿瘤学、微生物学等多个领域。典型的应用实例包括血液系统疾病的免疫分型，肿瘤学中细胞 DNA 的倍体和周期分析，细胞生物学研究中的细胞凋亡、增殖，细胞表面或胞内的抗原检测等。
其中，流式技术较为广泛的应用是使用流式抗体进行细胞的分型鉴定，常见的免疫表型分析实验包括单细胞悬液制备、细胞表面或胞内抗体的染色、上机检测等基本步骤。
两种常见流式细胞标记法
直接法和间接法各有利弊
直接法：荧光标记的抗体直接与细胞的抗原结合，一步孵育后即可以进行细胞的流式上机检测。直接法因为其方便快捷，交叉反应和背景少，是目前主流的流式标记手段。
间接法：细胞先与一抗进行孵育，然后荧光二抗再结合到一抗上形成免疫检测复合物，后续即可以进行上机。当商品化的直标抗体无法获得时，间接法可以作为补充，但间接法在多色实验中很难避免种属间的交叉反应，选择性会大大受到影响。
两种流式细胞标记法原理见图 1。
图 1 流式抗体标记常见的两种形式
（左图为直接法，右图为间接法）
除选择上述两种商品化标记抗体外，还可使用抗体标记试剂盒标记抗体，获取实验所需的荧光标记抗体，但该方法对技术要求高，标记效果往往受多种因素影响。常见的传统流式细胞标记方法，见表 1。
表 1 常见的传统流式细胞标记方法
因素
直接法
间接法
标记试剂盒
耗时
一步操作，耗时少
多步操作，耗时长
耗时更长，往往需 1 个小时甚至数天
复杂性
不复杂，流程短
复杂，必须选择合适的二抗，多色实验中很难避免种属间的交叉反应
流程更复杂，需要考虑多种因素如抗体浓度、专业技术知识、反应清洗等
灵活性
不灵活，商品化决定
灵活，使用不同的二抗可拓宽可测量靶标的范围
操作更灵活，可人工组合偶连
灵敏度
低于间接法
反馈更灵敏，一抗上可结合多个二抗分子
低于间接法
背景
低背景，减少了非特异结合
更多背景，可能存在内源性结合
更多背景，操作复杂，任何环节出错均会影响结果
多色流式分析
可同时定量检测细胞多种特性但要求高
随着流式细胞仪、单克隆抗体和荧光探针的不断发展，流式分析已经从早期的单激光单色检测，发展到可快速同时定量检测一种细胞的多种特性，多色多参数多激光的检测分析。
同时分析多个抗原或多种细胞特性的能力为越来越复杂的实验打开了新的大门，但多色流式细胞分析需要平衡多个难题的解法，包括仪器配置、抗原表达和染料亮度，以及可用的抗体- 染料组合等，考虑的要素见图 2。
图 2 流式多色方案设计需要考虑的要素
流式的配色需要综合考虑以下因素：
仪器的配置：抗体所选择的荧光染料必须根据仪器的激光通道以及相应的滤片配置进行选择。
抗原的表达量：待测细胞类群的丰度以及荧光染料的亮度。常见的配色原则是将亮度高的染料配给低丰度的抗原或者低丰度细胞上的抗原。
荧光标记的抗体的可选择性：从供应商处选择流式验证过的符合配色需求的抗体，如果无法找到合适的供应商，则可以考虑使用荧光二抗进行间接标记，但这种方案可能会造成种属间的交叉反应以及高背景的问题。
如果研究人员无法在一次实验中妥善调和上述因素，就需要退而求其次，进行多次分析。而多次分析难免引入各不相同的实验条件，由此造成的数据波动最终会导致数据结果不可靠。
默克创新型多色流式分析解决方案
简化多色流式分析流程
ColorWheel® 流式抗体和染料组合采用专为流式细胞术优化的专（禾刂）技术，支持用户分别选择抗体和染料并根据自身需要任意组合，在保证实验成功率的同时又可帮助简化流式细胞分析流程，突破传统流式分析方案的局限。
主要优势：
突破局限：可灵活选择抗体和染料进行搭配组合，解锁多色流式分析的无限可能。
简化流程：简单三步操作即可制备即用型抗体-染料溶液，实操时间不超过 5 分钟。
高效稳定：单克隆抗体兼备高特异性和可重复性，冻干粉形式增强运输和储存稳定性。
洁净兼容：无防腐剂，兼容的样品类型更广。
ColorWheel® 技术基于专（禾刂）的寡核苷酸配对连接技术将抗体与染料偶联起来（详见图 3），偶联产物与荧光标记的直标抗体保持一致，可以直接用于流式的标记检测。该技术的偶联过程只需要简单的 1:1 的混合，其偶联过程比起传统的抗体标记方法大大简化。ColorWheel® 流式抗体的选择灵活性能让使用者更加灵活的设计多色方案，摆脱由于抗体荧光组合缺失导致的配色困境（详见表 2）。
图 3 ColorWheel 流式抗体偶联技术示意
表 2 Colorwheel® 助力突破传统多色流式分析的局限
传统方法
传统方法的局限
Colorwheel® 方案
标记一抗
同时需要目标抗体以及与仪器兼容的染料
支持任意ColorWheel® 抗体和染料的组合，操作更灵活
标记二抗
需要多次反复洗涤，存在交叉反应性问题
ColorWheel® 抗体和染料通过 3 步即可完成结合反应，尽可能降低复杂物种反应性和反复洗涤引起的抗体损失风险
标记试剂盒
耗费更多时间和成本，并导致数据波动
ColorWheel® 抗体和染料无需额外的标记试剂盒，既节省时间，又节省成本，并可规避标记步骤带来的数据误差
应用举例：
ColorWheel® 不仅可以简化流式细胞分析流程，突破传统流式分析方案的局限，同时可以保证在多重指标的流式实验中具有优异的表现。
以下实验检测了免疫 T 细胞检测常用的指标 CD3，CD4，CD44，CD45RA，该 4 重指标的实验用来评估 CD4+ 辅助型T细胞的激活状态。结果显示，ColorWheel® 流式抗体与传统的流式抗体具有同样优异的表现（详见图 4）。
图 4 ColorWheel 流式抗体与传统流式抗体的检测效果比较（左边是 ColorWheel® 结果，右边是传统数据）
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