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    报告基因:β-半乳糖苷酶的原位染色实验方法

    发布时间: 2021-11-05  点击次数: 270次
    材料与仪器

    β-gal表达质粒转染细胞
    D-PBSA 染色液
    6 孔培养板 恒温箱 倒置显微镜

    实验步骤


    一、材料
    非消毒物品 


    1. D-PBSA


    2. 底物:X-gal(nvitrogen),以二甲基甲酰胺配成 20 mg/mL,用多聚丙烯管-20℃ 避光保存,最长可达 6 个月 


    3. 固定液:1.8% 的甲醛和 0.05% 戊二醛,均以 PBSA 液配制;将 85 mL 水、10 mL 的 10x D-PBSA、5 mL 福尔马林(37% 甲醛溶液)及 0.2 mL 戊二醛(25% 溶液)混合,制备成固定液,于 4℃ 储存 


    4. 染色液:含 5 mmol/L 铁氰钾,5 mmol/L 亚铁氰钾,2 mmol/LMgCl2,以 D-PBSA 配制,4℃ 储存 


    5. 底物/染色液:1 mg/mLX-gal,以染色液配制,现用现配 


    6. 含 10% 甲醛的 D-PBSA 液 


    7. 将β-gal 的表达质粒作为报告基因转染(如:pcMV β-gal )


    二、操作步骤:
    1. 用 2 mL D-PBSA 液洗涤细胞(如在 6 孔培养板上)。


    2. 用 1 mL 固定液于室温下固定细胞 5 min。


    3. 用 2 mL D-PBSA 洗涤细胞 2 次。


    4. 将 1 mL 底物/染色液加入到每个培养孔内,37℃ 孵育 2 h。


    5. 用 2 mL D-PBSA 液冲洗每孔细胞,在倒置显微镜下观察细胞,计数蓝染(β-gal 阳性)细胞。


    6. 培养板的储存。在每孔加 1 mL 含 10% 甲醛的缓冲盐溶液,室温下固定 10 min,然后用缓冲盐溶液洗涤细胞,4℃ 储存缓冲盐溶液。



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