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    初代细胞培养——消化培养法

    发布时间: 2021-11-08  点击次数: 381次
    材料与仪器

    组织
    Hanks 培养液 胰蛋白酶
    吸管 平皿 培养瓶 烧杯 搅拌器 三角烧瓶 不锈钢筛 眼科剪 眼科镊 计数板

    实验步骤

    1.  准备

    取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20 分钟;


    2.  布局

    点燃酒精灯(或煤气灯),安装吸管帽(应通过火焰);

    3.  处理组织

    把组织块置入烧杯中,用Hanks液漂洗2~3 次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60 分钟;

    4.  剪切

    用眼科剪把组织块切成2~3 毫米大小的块(用手术刀割亦可),以便于消化;加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞;

    5.  消化

    或用恒温水浴,或置入37 ℃温箱消化均可,消化中每隔20 分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好(消化前瓶中需置一无菌搅棒);消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定;

    6.  分离

    在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块(必要时可继续进行消化);低速(500~1000 转/分)离心消化液5 分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液(如有其它酶或EDTA 等消化,需用Hanks液洗脱一两次后,再加入培养液);

    7.  计数

    用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中;对大多数细胞来说,pH 要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说胆液体变酸,可用NaHCO3调整;

    8.  培养

    置入36.5 ℃温箱培养;如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需更换新塞。



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