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    大鼠肝星状细胞原代培养实验——胰酶消化法

    发布时间: 2021-12-04  点击次数: 400次

    材料与仪器

    SD大鼠
    戊巴(匕匕)妥钠 小牛血清 DMEM 酶消化液 D-Hanks' 液 酚红 台盼兰 HBSS 氯化钠 PBS
    手术刀 手术剪 尼龙网 相差显微镜 荧光显微镜

    步骤


    一、实验材料准备

    1.  动物:雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
     
    2.   试剂:戊巴(匕匕)妥钠,小牛血清(或胎牛血清,则更好),DMEM,酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配),18% Nycodenz(以GBSS配),D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L,KH2PO4 0.06 g/L,NaCl 8.0 g/L,NaHCO3 0.35 g/L,Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L,可加酚红 0.02 g/L),HBSS,台盼兰等。
     
    3.  器械:手术器械,200目尼龙网,相差显微镜,荧光显微镜。
     
    二、原代培养方法
     
    1.  大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹,进行门静脉插管,以D-Hanks'液灌注,同时剪开下腔静脉,冲掉血液后,改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。

    2.  待肝脏变软后,离体肝脏并剪碎,继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min,尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃,下同)。

    3.  以HBSS重悬沉淀至10 ml,再混以20 ml Nycodenz液,分置于离心管中,并分别覆以2-3 ml HBSS,1450 g离心16 min后取界面细胞。

    4.  以HBSS重悬后再次离心收集细胞,以DMEM重悬后进行细胞计数,并判断存活率和产量,最后按照常规方法接种(105细胞/cm2),次日换液,以后每2-3天换液一次。
     
    三、传代方法

    弃去培液后以D-Hanks'液洗两次,加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化,镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右),以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA,可以不需离心),充分吹打后以1:2-1:3接种,然后继续培养(5%CO2,37℃)。
     
    四、 结果
    接种次日,光镜下可见细胞呈星芒状,胞质内有脂滴,荧光镜下328 nm处见自发荧光。附上发表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(图1)。


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