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    薄层层析法测定氯霉素酰基转移酶含量实验

    发布时间: 2021-12-16  点击次数: 210次

    材料与仪器

    用携带感兴趣 DNA 的 pCAT 载体转染的哺乳动物培养细胞
    CAT 反应混合物 1 乙基乙酸 裂解缓冲液 不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液 薄层层析(TLC) 溶剂 Tris-Cl 放射性墨水
    干冰 乙醇浴 不溶于乙醇的墨水的记号笔 旋转真空蒸发器 橡胶棒 薄层层析板 薄层层析槽 预设为 65°C 的水浴

    步骤

    材料

    缓冲液和溶液
    贮存液、缓冲液和试剂的组分请见附录 1。
    贮存液稀释到适当浓度。

    CAT 反应混合物 1
    1mol/LTris-Cl(pH7.8)50ul
    [14C] 氯霉素 (60mCi/mmol, 用水稀释到 0.1mCi/ml)10ul
    乙酰辅酶 A(新鲜配制,水溶液浓度 3.5 mg/ml)20ul
    每测定 50ul 细胞裂解物需要准备 80ulCAT 反应混合物。反应混合物在临用前配制。
    乙酰酶 A 是辅酶 A 的 S-乙酰基化形式。两个碘单位以这种形式从脂肪和碳水化合物进入柠檬酸循环。乙酰辅酶 A 在很多生物反应中作为乙酰基化的辅助因子,如在本方案中,通过 CAT 使氯霉素酰基化就需要乙酰辅酶 A 作为辅助因子。

    乙基乙酸
    乙基乙酸(CH2COOCH2CH3) 是用于 CAT 活性薄层层析测定的有机溶剂。1 份乙基乙酸和 19 份氯仿混合制成的溶剂可以把乙酰基化和非乙酰基化形式的氯霉素在硅胶板上分开。乙基乙酸是非常易燃(闪燃点=-4°C) 的挥发性酯类,有成熟水果的味道。



    裂解缓冲液
    0.1mol/LTris-Cl(pH7.8)
    0.5%(V/V)TritonX-100
    通过去污剂裂解细胞时使用(请见步骤 4)。
    同样的裂解缓冲液可制备用于测量β-半乳糖苷酶活性的细胞抽提物(请见方案 7)。
    重要:细胞裂解缓冲液需用髙纯度的 TritonX-100 制品。低等级的去污剂会抑制 CAT 酶活性。裂解緩冲液中可以用去污剂0.125%(V/V) 的 NonidetP-40 代替 TritonX-100。

    不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液(PBS)

    薄层层析(TLC) 溶剂
    190 ml 氯仿
    10 ml 甲醇
    毎个 TLC 槽需要准备 200 ml。每个槽可以用两个 TLC 板。

    Tris-Cl(1mol/L,pH7.8)

    放射性化合物

    放射性墨水
    用于作点标记,指示 TCL 柜放射自显影图的方向。

    特殊设备

    干冰/乙醇浴
    用于冻融法裂解细胞。

    使用不溶于乙醇的墨水的记号笔

    旋转真空蒸发器
    例如 Savant Speed Vac 牌。

    橡胶棒

    薄层层析板(例如 Sybron SIL G/UV254,Brinkmann 公司)

    薄层层析槽(27.5 cm X27.5 cm X7.5 cm)
    科学供应品商店提供这类槽(如 Sigma-Aldrich Techware 公司)。

    预设为 65°C 的水浴

    细胞和组织

    用携带感兴趣 DNA 的 pCAT 载体转染的哺乳动物培养细胞
    需要用一个 CAT 报道分子载体(如 pCAT3 系列)和带有β-半乳糖苷酶基因(pCMV-SPORT-β-gal;请见第 16 章图 16-2) 或其他适于使 CAT 测量结果标准化的报进基因的质粒共转染(使用第 16 章中的某种转染方案)细胞。pCAT 系列载体的详细情况请见图 17-3。

    方法

    转染细胞沉淀的制备

    1. 从经过转染并在 90 mm 组织培养皿中生长的单层细胞轻轻地吸掉培养液。单层细胞用 5 ml 不含钙盐和镁盐的 PBS 洗 3 次。

    2. 把培养皿以某个角度放置 2~3 min,使最后残留的 PBS 流到一侧。吸掉 PBS 残液。每个培养皿加 lmlPBS,用橡胶棒把细胞刮到离心管中。冰浴,直到所有的培养皿处理完毕。

    3. 室温下以最大速度离心 10s 收集细胞。用 lml 冰冷的 PBS 轻轻地重悬细胞沉淀,然后再次离心收集细胞。去掉细胞沉淀与管壁中的 PBS 残液。细胞沉淀可以贮存在-20°C 以作将来分析用,也可以用步骤 4 的某种方法制备细胞抽提物。
    用连有真空管的一次性吸头可以很方便地去除 PBS。吸头接触液面,缓缓地吸。当液体下降的时候. 使吸头尽可能地远离细胞沉淀,然后用吸头吸掉沾附在管壁上的液滴。

    制备细胞抽提物

    4. 裂解细胞是用反复冻融法或用含有去污剂的缓冲液处理细胞。后一种方法快速简便,而且适用于在 96 孔板上测量 CAT、β-半乳糖苷酶和其他标记基因(方案 6)(Bignon et al.1993)。

    反复冻融法裂解细胞

    a. 在 90 mm 培养皿中,用 l00ul 0.25mol/L Tris-Cl(pH7.8) 重悬细胞沉淀。剧烈振荡打散细胞团块。

    b. 细胞在干冰/乙醇浴中冻,在 37°C 融解,并进行 3 个循环以破坏细胞。确定管子事先用不溶于乙醇的墨水进行过标记。

    c. 破碎的细胞在 4°C 以最大速度离心 5 min。上清转移到新的离心管中。取 50ul 上清用于測量 CAT, 余下的抽提物贮存于-20°C。

    用含有去污剂的缓冲液裂解细胞

    a. 步骤 3 中的细胞沉淀用 500ul 裂解缓冲液重悬。混合物在 37°C 孵育 15 min。
    在 35 mm 培养血中生长的细胞抽提时需要用 100ul 裂解缓冲液。

    b. 以最大速度离心 10 min 去除细胞碎片。回收上淸。选用一种本方案所述的方法来测量 CAT 活性。余下清亮的裂解物在液氮中速冻,然后贮存在-70°C。

    用薄层层析法测定 CAT 活性

    5.50ul 细胞抽提物在 65°C 孵育 10 min 使内源性的去乙酰基酶失活。如果这时候抽提物混浊不透明,在 4°C 最大速度离心 2 min 以去除微粒。

    6. 每个待测样品用 80ulCAT 反应混合物 1 混合,37°C 孵育。孵育时间的长短与细胞抽提物中 CAT 的浓度有关,而 CAT 的浓度又与所研究的启动子强度和细胞类型有关。大多数情况下,孵育 30 min 到 2 h 就足够了。
    如果转染的细胞中 CAT 基因表达很低,这步反应可以孵育更长的时间(最长至 16 h)。但最在这种情况下,建议毎个反应孵育 2 h 后再补加 10ul 乙酰辅酶 A。

    7. 每个样品加 lml 乙基乙酸,振荡 3 次,每次 10s, 彻底使溶液混匀。混合物在室温下以最大速度离心 5 min。
    乙酰基化的氯霉素进入到有机相(上层)中;非乙酰基化的氯霉素仍留在水相中。

    8. 用移液管把 900ul 有机相转移到新管中,小心避免水相和中间相混入。把含有下层相的管子作为放射性废物丢弃。

    9. 把管子放入旋转蒸发器(如 Savant SpeedVac 牌), 真空下使乙基乙酸挥发约 lh。

    10. 每个管子加 25ul 乙基乙酸,轻轻振荡,使反应产物溶解。

    11. 把 10~15ul 已溶解的反应产物加到 25 mm 硅胶 TLC 板的起点处。板上的起点用软石墨铅笔标记。每次加样 5ul, 用吹风机把样品吹干。

    12. 准备盛有 200 mlTCL 溶剂的 TCL 槽。把 TCL 板放进槽中,关上容器,然后使溶剂前沿移动到板上端大约 75% 的地方。
    可以用许多不同的 TCL 板和指剂来分离乙酰基化的氯霉素。我们通常用氯仿:甲醇 (95:5) 和 Sybron SILG/UV254(Brinkmann 公司)TCL 板。Touchstone(1992) 对 TCL 方法及其疑难问题作了很好的介绍和说明。

    13. 把 TCL 板从槽中取出来,在室溫下干燥。用放射性墨水在 TCL 板上作点标记以便于对齐板与胶片的位置,然后用板对 X 射线胶片曝光。或者把板放在磷屏分析的盒子里。盒子在室溫下放置适当的时间。
    TCL 板上不要盖 Satan 膜,因为盖上膜之后会隔断 14C 同位素发出的较弱的放射线。

    14. 冲洗 X 射线胶片并与 TCL 板校对位置。此外,还可以用层析图对磷屏分析设备的图像板曝光或把 TCL 板拿去扫描。
    通常可看到三个放射性斑点。从起点迁移距离最近的点是进入乙基乙酸的非乙酰基化的氯霉素。另两个迁移得稍快的斑点是两个潜在的可酰基化位置中的某一个被乙酰基化的氯霉素。只有当使用了高浓度 CAT 或用大量抽提蛋白进行长时间的孵育后,才能看到迁移得更快的第三种斑点,它是双乙酰基化的氯霉素。

    15. 为了对 CAT 活性定量,需要从 TCL 板中把放射性斑点切下来,然后用液闪计数器测定放射性量(请见附录 9)。取另一份细胞抽提物(来自前面的步骤 3),用 Bradford 分析法等快速比色法确定抽提物中的蛋白浓度。测定蛋白浓度前,把 Triton X-100 的浓度稀释为≤0.1%, 以免发生交叉反应。CAT 活性表示为每单位时间每毫克细胞抽提物蛋白中产生乙酰基化产物的皮摩尔数。
    当处理大量样品时,先硅胶薄层度析,接着切胶和对修饰过的氯霉素产物进行闪烁计数的方法会变得非常腻味,这些情况下进行产物定量的另一种方法是用磷屏设备对 TCL 板进行扫描。
    在不含细胞抽提物的情況下仍然「固有」的氯霉素己酰基化可能会形成背景。如果这会有问题,试着把实验中氯霉素的浓度降低 2-4 倍(Heard et al.1987)。


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