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    哺乳动物 DNA 的快速分离

    发布时间: 2021-12-17  点击次数: 218次

    原理

    根据本方案制备的哺乳动物 DNA 约 20~50 kb,适于作 PCR 反应的模板。DNA 产量在 0.5 到 3.0 μg/mg 组织之间变化,或者是 5~15 μg/300μl 全血。

    材料与仪器

    无 DNase 的 RNase 蛋白酶 K 哺乳动物组织或全血
    细胞裂解缓冲液 乙醇 异丙醇 醋酸钾溶液 红细胞裂解缓冲液 TE
    连有真空管的抽吸装置 微量离心研棒 水浴

    步骤

    一、材料

    1. 缓冲液及溶液

    细胞裂解缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA ( pH 8.0),0.1%(m/V) SDS)

    乙醇

    异丙醇

    醋酸钾溶液(60 ml 的 5 mol/L 醋酸钾,11.5 ml 冰醋酸,28.5 ml 水)

    红细胞裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)

    TE ( pH 7.6)

    2. 酶及缓冲液

    无 DNase 的 RNase ( 4 mg/ml)

    蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

    3. 专用设备

    连有真空管的抽吸装置

    微量离心研棒

    预先调到 55℃ 或 65℃ 的水浴

    4. 细胞和组织

    哺乳动物组织或全血

    二、方法

    1. 准备用于分离 DNA 的组织或全血

    (1) 组织

    ① 切下 10~20 mg 组织。

    ② 用剃刀或解剖刀切碎组织或者将组织冷冻于液氮中,用在液氮中预冷的研钵研磨成粉。

    (2) 血液

    ① 在两个微量离心管中分别转移 300 μl 全血样品。每管中加入 900 μl 红细胞裂解缓冲液,盖上盖子,颠倒混匀。溶液于室温下放置 10 min, 中间颠倒混匀几次。

    ② 室温下用最大转速离心 20 s。

    ③ 每管保留 20 μl 上清,弃去其他部分。

    ④ 用剩余的少量上清重悬白细胞沉淀。将两管中的沉淀合成一管。

    2. 将切碎的组织或者重悬的白细胞沉淀转移到加有 600 μl 冰冷的细胞裂解缓冲液的离心管中。用微量研棒迅速研磨 30~50 下,混匀悬浊液。

    3. (可选择的)向裂解产物中加入 3 μl 蛋白酶 K, 以增加基因组 DNA 的产量。消化液置于 55℃ 放置 3 h 以上,但不要超过 16 h。

    4. 消化液降至室温,然后加入 3 μl 4 mg/ml 的无 DNase 的 RNase。37℃ 放置 15~60 min。

    5. 将样品降至室温。加入 200 μl 醋酸钾溶液,剧烈振荡 20s 使其充分混合。

    6. 用最高转速 4℃ 离心 3 min, 使蛋白/SDS 复合物沉淀出来。

    7. 将上清转移到加有 600 μl 异丙醇的新离心管中。充分混合,然后用最大转速室温下离心 1 min 收集 DNA 沉淀。

    8. 吸去上清,加入 600 μl 70% 的乙醇。颠倒管子数次,用最大转速室温下离心 1 min。

    9. 小心吸去上情,空气中干燥 DNA 沉淀 15 min。

    10. 将 DNA 沉淀溶解于 100 μl TE ( pH 7.6)。

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