从M13噬菌体模板合成固定长度的单链DNA探针

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙酸铵（10 mol/L）

DTT (1 mol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

NaCl ( 5 mol/L)

酚：氯仿（1:1, V/V)

5X TBE 电泳缓冲液

Tris-Cl (1 mol/L，pH 7.6)

2. 酶和缓冲液

10X Klenow 基础缓冲液（500 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5)，100 mmoI/L MgSO4，过滤除菌后，分装成小份贮存于 -20℃。）

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

适于制备所需探针的限制性内切核酸酶

3. 凝胶

变性聚丙烯酰胺凝胶或碱性琼脂糖凝胶

4. 核酸与寡核苷酸

含有浓度各 20 mmol/L 未标记的 dCTP、dGTP 和 dTTP 的 dNTP 溶液

dATP ( 40 μmol/L 和 20 mmol/L)

寡核苷酸引物（M13 噬菌体通用引物或定制的寡核苷酸）

模板 DNA

5. 放射性复合物

[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 800~3000 Ci/mmol）

6. 专用设备

放射性墨水标记的黏性贴片或磷光黏性贴片（如 Glogos, Stratagene 公司）

盛有 85℃ 水的烧杯（250 ml）和微量离心管的支架

Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6)平衡

预热至 68℃ 和 85℃ 的水浴或加热块

预热至限制性内切核酸酶消化的适当温度的水浴

二、方法

1. 在一个 0.5 ml 的微量离心管中混合：

单链模板（M13 噬菌体或噬粒 DNA ) ( 约 0.5 pmol)  1 μg

寡核苷酸引物                                                         5 pmol

10X Klenow 基础缓冲液                                          3 μl

水                                                                         加至 20 μl

2. 85℃ 加热反应混合物 5 min，然后缓慢冷却至 37℃。

3. 在含有复性的引物和模板的试管中加入：

0.1 mol/L DTT                                    2 μl

10 mCi/ml [α-32P] dATP

( 比活性 3000 Ci/mmol)                       5 μl

40 μmol/L dATP                                 1 μl

20 mmol/L dTTP、dcTP 和 dGTP 溶液 1 μl

轻敲管外壁以混合各成分。以最大速度在微量离心机中离心 1~2s 使所有液体沉降至管底。

4. 将 0.5 μl 的混合物转移到含 15 μl 20 mmol/L EDTA（pH 8.0）的微量离心管中，将管置于冰上。

5. 在剩余的反应混合物中加入 1 μl ( 5 单位）的 Klenow 片段。轻敲管壁使反应各组分混匀。室温温育反应 30 min。

6. 取 0.5 μl 的反应物转移至含有 20 μl 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0 ) 的新的微量离心管中。将管置于冰上。

7. 在剩余的反应液中加入 1 μl 20 mmol/L 未标记的 dATP，轻弹管外壁以混合反应物。以最大速度离心 1~2s 使所有液体沉降到管底。室温下继续温育 20 min。

8. 在 20 min 温育过程中（步骤 7)，用步骤 4 和步骤 6 中保存的样品来确定转移至 10% 三/氯/乙/酸（TCA）可沉淀物或附着于 DE-81 滤膜的分子的放射性活度的比率。

9. 于 68℃ 加热反应物 10 min 以灭活 Klenow 片段。

10. 调整反应中 NaCl 的浓度使之符合所选用的限制性内切核酸酶最适酶切条件。切记引物延伸反应中 NaCl 浓度为 50 mmol/L。

11. 加 20 单位所需的限制性内切核酸酶，在适当温度下温育 1 h。

12. 用标准的酚: 氯仿抽提法纯化 DNA，通过离心柱层析或用 2.5 mol/L 乙酸铵和乙醇分级沉淀法除去未掺入的 dNTP。加 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 至终浓度为 10 mmol/L。

13. 根据片段大小选用变性聚丙烯酰胺凝胶或碱性琼脂糖凝胶电泳分离放射性标记的 DNA。

14. 电泳后，准备进行凝胶的放射性自显影。将凝胶在 X 线胶片上曝光 5~10 min。

15. 底片冲好后，利用磷光点（Glogos) 或放射性墨水斑点将显影胶片与凝胶对齐。将胶片贴于凝胶上，在凝胶板的背面标出引物延伸的放射性 DNA 片段的位置。撤去胶片，切下含有所需 DNA 片段的凝胶块。

16. 如用聚丙烯酰胺凝胶分离 DNA 片段与模板，则进行步骤17。如用碱性琼脂糖凝胶，在洗脱放射性标记的 DNA 之前，应先在 0.5 mol/L Tris-Cl( pH 7.6 ) 中轻轻振荡 45 min、然后在 0.5X TBE 中振荡 45 min 以中和凝胶。

17. 采用电洗脱法抽提凝胶中的 DNA 或挤碎聚丙烯酰胺凝胶块，再将其浸泡于适当缓冲液以便抽提 DNA。

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