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    IPS细胞怎么诱导分化?

    发布时间: 2022-01-04  点击次数: 332次

    IPSC生成通常是实现真正的实验目标的中间步骤。

    它一般应用于:

    人胚胎发育建模;

    作为难以分离的细胞来源,用于基础研究和疾病建模;

    药物筛选应用;

    细胞替代治疗。


    IPS神经分化的protocol,以下是神经细胞的分化操作步骤,可供参考:

    准备好神经诱导分化的培养基,建议使用Essential 8TM培养基以Matrigel基质胶作为基质,或者使用StemPro hESC SFM培养基以Geltrex作为基质。


    1、高品质的PSCs(无分化或者仅含少量分化的克隆)是进行有效的神经诱导的关键。在传代PSCs时去除所有的或者大部分分化的克隆。分化的克隆可以通过使用Nikon显微标志和Nikon显微C-OA 15mm目标适配器被标记


    2、当PSCs达到~70-80%融合时,根据PSC分种实验方法将PSC接种到6孔板中在分种PSC团块前,确定分种的密度,方法如下:


    3、当准备好PSC细胞悬液后,取部分细胞到15-ml锥形管中来估算PSC细胞悬液的总细胞量(如,将6孔板的一个孔中的细胞制备成6ml PSC细胞悬液,邓1ml来进行细胞数估算)。


    4、将装有细胞的15-ml锥形管以200×g离心3分钟,弃上清。


    5、加入1ml预热的StemPro Accutase细胞消化液,37度孵育5分钟。


    6、用1ml的移液管上下猛烈的吹吸5次,将细胞分散成单个细胞悬液。


    7、选择你常用的方法计数总细胞数。如果在1ml Accutase细胞消化液中的总细胞数为1×10^6,那么剩下的5ml PSC细胞悬液中的总细胞数为1×10^6×5=5×10^6


    8、加入2.5ml PSC培养基至包被好的6孔板的每个孔中。


    9、温和的混匀有PSC细胞悬液的锥形管,将PSCs以2.5×10^6-3×10^5的数量接种到每个孔中。例如,如果PSC悬液为1×10^6个细胞/ml,将0.25-0.3ml PSC悬液加入到每个孔中。


    10、快速的前后左右晃动培养皿,将细胞分散到整个表面,于CO2培养箱中培养。


    以下点需要注意:

    1、分种 的比例根据在分种前PSCs的融合程度用PSC细胞系类型的不同而有所差异。在分种后的第一天即开始进行神经诱导(大约传代后24小时)。在传代PSCs时,PSCs的起始密度应该在15-25%的融合细胞需要以团块状接种,避免成为单个细胞。单个细胞接种PSC易增加细胞的死亡。

    2、在分种的时候可以将10um ROCK抑制剂加入到PSC培养基中处理过夜,以防止细胞的死亡。

    3、如果起始用的PCS状态很差,非神经样的克隆将会在培养中出现。在这种情况下,可以有两种操作选择:

    a、如果仅在培养皿的极少区域出现该细胞形态,在挑除非神经样分化的克隆后可以继续培养。为了去除非神经样分化的克隆,先用显微标记出所有非神经样分化的克隆。倾斜培养皿,用巴氏玻璃吸管将标记的克隆吸掉去除。将培养皿旋转180度,重复以上步骤。操作每个孔时均重复以上步骤,以避免细胞缺少培养基而需经受无培养基压力。

    b、如果出现了大量的非神经样的克隆,建议放弃继续培养,而选择高品质的PSCs重头开始。

    c、更换培养基一定要注意,请预热完全培养基,冰冷的培养基加入会导致细胞皱缩和漂浮。



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