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    如何提高蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)的成功率?

    发布时间: 2022-01-05  点击次数: 451次

    近些年来,蛋白质组学研究是生物领域比较热门和研究广泛的方向。而Western Blot实验是研究蛋白组学的基本实验操作。但是一个成功的Western Blot实验结果需要注意很多细节。

    Western Blot即蛋白质免疫印迹实验,利用抗原抗体特异性结合来检测目的蛋白的表达量。蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所(Friedrich Miescher Institute)的Harry Towbin1979年提出的。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中第一次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或组织中的蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

    图片

    下面详细介绍每一步的操作:

    一、样品的制备

    样本来源一般分为细胞和组织,常用的裂解液为RIPA(强)裂解液,需要加入适量的蛋白酶抑制剂。根据所收集的细胞沉淀多少或组织块大小,加入适量的裂解液。根据说明书,冰上裂解10min30min,定时进行涡旋震荡。用BCA试剂盒进行蛋白定量,加入Loading Buffer99℃的金属浴上煮样10min

    *加入的Loading Buffer目的

    主要成分

    主要功能

    SDS

    使蛋白质变性并带上负电荷

    甘油

    增加样品密度,使样品沉降

    溴酚蓝

    离子型染料,可观察蛋白的迁移

    DTT

    减少二硫键的形成

    二、凝胶电泳

    * SDS凝胶配置原则:

      先配置分离胶,再配置浓缩胶;

      分子量越高,分离胶浓度越低;

      根据上样量选择对应的玻璃板和梳子。

      配胶成分表:


    分离胶15%

    分离胶12%

    分离胶10%

    分离胶8%

    浓缩胶5%

    总体积

    10ml

    10ml

    10ml

    10ml

    5ml

    30%丙烯酰胺(29:1

    5ml

    4ml

    3.3ml

    2.7ml

    0.83ml

    4XSDS-PAGE浓缩胶

    0

    0

    0

    0

    1.25ml

    4XSDS-PAGE分离胶

    2.5ml

    2.5ml

    2.5ml

    2.5ml

    0

    10%过硫酸铵

    40ul

    40ul

    40ul

    40ul

    30ul

    TEMED

    4ul

    4ul

    4ul

    4ul

    3ul

    ddH2O

    2.4ml

    3.4ml

    4.1ml

    4.7ml

    2.84ml

    最佳分离范围

    10-40KD

    12-60KD

    20-80KD

    30-90KD

    ——

    配胶注意事项:

      (1)清洗玻璃板:可以先用海绵擦清洗玻璃板,在用去离子水润洗一次,可以放置于烘箱或通风厨中晾干。

      (2)按照配胶表进行配置,充分混匀后在玻璃板中灌胶。

      (3)加水或者醇类液封,速度要慢,防止将分离胶冲不匀或变形。

    电泳

    采用SDS-PAGE电泳,每孔上样量可为20-50ng。在适当空内加入marker。先用80V电压使样品进行充分浓缩,到达分离胶后调为120V,当溴酚蓝要跑出即可终止电泳,进行转膜。

    转膜

    一般分为PVDF膜和NC膜,PVDF膜价格较贵,结合能力较强;NC膜价格便宜,结合能力较PVDF膜差,不能重复使用。

    PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20 kDa的蛋白选用0.45 um的膜,小于20 kDa的蛋白选用0.2 um的膜。PVDF膜在使用时需预处理,用甲醇激活15s,目的是活化膜上的正电基团,使其更容易与带负电的蛋白结合(注意:不要有气泡!不要将胶放干!原理:电场力作用条件下,PAGE胶中的带负电荷的蛋白会发生定向迁移)。转膜过程会产热导致蛋白质降解,因此要使用冰袋散热。目前市面上的快速转膜液可以在常温下400mA30min完成,方便快捷。

    注意事项:

      如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层虑纸也不能因过大而相互接触,这样同样会短路,电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的,最后结束时一般是开始的 1.5-3 倍都是正常的。一般 Buffer 和滤纸选的对就不会短路。

    转膜方法:湿转

    图片

    转膜后可以用丽春红对膜进行染色,检验转膜效率。

    封闭

    一般用5%的脱脂奶粉或者5%BSA进行封闭。对于磷酸化或者生物素标记的抗体只能用5%BSA。封闭是假为室温1-2h。目的是去除非特异性结合。

    一抗孵育

    封闭后用TBST润洗一次,然后根据蛋白的分子量大小进行裁膜,将对应的膜放入用一抗稀释液配好的抗体中(具体稀释比例要根据抗体说明书进行)。在4℃条件下置于摇床上孵育过夜。

    洗膜

    一抗孵育结束后,回收一抗,用TBST洗膜,每次7min,洗3次。

    二抗孵育

    洗膜结束后,加入配好的二抗(对应好一抗的种属来源),室温下置于摇床上1h,然后回收二抗,再次洗膜。

    显影

    PVDF膜洗干净后,滴加ECL发光液,孵育1min左右,可进行显影。

    Western Blot可能遇到的问题:

    无显色信号问题的原因分析:

    1.裂解产物中抗原含量不足;

    a. 抗原无表达或表达量过少

    b. 蛋白降解或上样量不足

    c. 裂解产物制备失误

    2.制胶浓度比例不合适;

    3.转膜不完全;

    4.一抗稀释浓度过大;

    5.二抗与一抗不匹配;

    6.显色系统灵敏度不足 

    非特意性杂带出现的原因分析:

    1.封闭或清洗不彻底;

    2.一抗浓度过高;

    3.蛋白降解;

    4.抗体与非特异性蛋白交叉反应;

    5.蛋白间聚集作用,形成二聚体;

    6.转移膜使用不当;

    7.操作过程中转移膜干燥

    有一些污点的原因分析:

    1.转膜有气泡;

    2.孵育不均匀;

    3.脱脂奶粉没有充分溶解


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    安培生物科技有限公司介绍:

    安培生物坚持为生命科学研究、活体动物转染、大规模生物生产、基因和细胞治疗领域客户,提供独特细胞体内可代谢的核酸转染试剂;inviCELL™Platelet lysate无动物血清产品旨在支持广泛的细胞扩增和生产,包括培养间充质干细胞和多种免疫细胞系等,为制药公司或者生物技术公司提供无血清细胞培养规模生产服务;提供以植物生物为平台基因序列全人源化、独特的细胞培养可分解3D基质胶产品;提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、对细胞无毒性影响、高纯度的一型胶原蛋白产品。安培生物专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务,努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业。


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