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    流式细胞术的空白对照、同型对照、FMO对照要怎么选?

    发布时间: 2022-01-10  点击次数: 2339次

    流式数据分析时,应该把门设在哪里合适呢,特别是那些分群不明显的结果。


    我们知道流式细胞术常见的有空白对照(未染色细胞)、同型对照和FMO对照,每种对照适用于什么情况呢?


    1、空白对照:空白对照的作用是作为电压调节的参考,调整电压参数使细胞信号在图上各个通道的合适位置。同时,也是可以看到细胞的本底信号,圈门时直接排除。


    未处理的细胞,不能作为处理组细胞的圈门依据,需要使用相同处理组的空白对照,来观察细胞的本底信号。



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    空白对照适用于细胞分群明显、背景荧光弱、已有大量研究的分群明确的细胞群圈门,例如CD3、CD4、CD8等等。


    2、同型对照(isotype):同型对照的作用是排除背景荧光,使用同型对照可以更准确地排除假阳性。


    例如,以下这张图,黑色线的是空白对照,黄色是同型对照,红色是实验组染色细胞,可以看出同型对照和空白对照会有所差别,会有少量的非特异性染色。



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    当非特异性染色比较强时,如果继续用空白对照作为圈门依据,实验结果就不能准确反映真实情况了。


    一般抗体说明书都会有同型对照和抗体染色的验证图,我们在选择抗体时尽量选择阳性峰与同型对照峰分得比较开的,通常抗体公司也会有此抗体对应的同型对照出售。


    3、FMO对照:FMO对照也叫做荧光扣除对照/抗体减一对照(Fluorescence-Minus-One Control),是指在多色染色分析时,对其中某一个通道设置的阴性对照,也就是不染目标通道的颜色,其他指标都染色。多在研究不同细胞亚群表达某些重要的表型分子、细胞因子等时应用。


    FMO对照有两个作用:


    (1)多色分析时,有些通道的信号不好区分,可能存在某个荧光对该通道干扰很大,可以使用FMO对照来找到这个荧光。



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    (2)作为我们需要重点分析的某个指标的阴性对照,可以排除全染的背景影响,有助于更准确地圈门。


    对于一些分群不明显,或表达量不高的指标,使用FMO对照作为圈门依据会比空白对照更合适。



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