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    SD大鼠骨髓间质干细胞培养方法技巧

    发布时间: 2022-01-15  点击次数: 354次


    SD大鼠骨髓间充质干细胞简单介绍:

           骨髓原始间充质干细胞(SD大鼠骨髓间充质干细胞)是骨髓基质干细胞,是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。它们对骨髓中的造血干细胞(HSC)不仅有机械支持作用,还能分泌多种生长因子(如IL-6,IL-11,LIF,M-CSF及SCF等)来支持造血。

         常用的分离MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法,(SD大鼠骨髓间充质干细胞)全骨髓法即根据干细胞在低血清培养基中有贴壁优势特性,定期换液除去不贴壁细胞,从而达到纯化及扩增MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分比重的不同,分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。随着对MSC表面抗原认识的深入,又有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化。但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题,加之成本较高和技术的难度,在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。


    常见分离方法


    目前BMSCs的分离方法主要有:

    ✦ 贴壁分离法:根据BMSCs的粘附特性来实现分离贴壁的方法;

    ✦ 密度梯度离心法:根据BMSCs与其他细胞的密度不同来分离的方法;

    ✦ 流式细胞仪分离法:根据细胞大小或者根据细胞表面的一些特殊标志来分离的方法。



    密度梯度离心法与流失细胞仪分离法价格昂贵且操作复杂、容易导致细胞大量流失,应用相对较少。贴壁培养法应用最早,具有操作简单,对细胞干扰少,不易发生污染等特点较为广泛应用,其缺点是细胞纯度较低,但有关研究表明,BMSCs细胞扩增到P1、P2代后细胞的纯度分别可达到95%、98%。


    大鼠骨髓间充质干细胞细胞传代能力测试

    大鼠骨髓间充质干细胞生长快速,高密度会影响细胞干性,建议按照1:3比例传代细胞,传代建议使用胰酶浓度为0.05%进行消化。消化每t25培养瓶加胰酶1ml。消化时间约1-2min内,t25培养瓶培养液约7ml完全培养基。

    本次验证:传代图如下(4X)

    P1-P5代,按照1:3比例传代,48H(隔天)传代一次。每次细胞状态和增殖能力均良好。

    P6-p8代1:3传代,72h(隔两天)传代一次。

    P8-P10代1:3传代,144h(隔6三天)传代一次。

    此时细胞个体变大,生长速度明显减慢。


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    细胞形态图:

    细胞处于快速分裂的状态,良好的MSCs显示较小的纺锤状的形态,伴有较多的折光的双联体,为新的正在分裂的细胞。细胞首代状态较好,多数呈长梭形生长,部分不规则,极性良好,经传代 5次后,细胞仍较有活力。以1:2 的分种率传代,约48h可长满。

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    分化测试

    1. 成脂诱导分化

    细胞汇合度约达 80%时,加入间质干细胞成脂诱导液后,细胞回缩较明显。11 天后已有大量脂滴出现,培养21天后进行油红O 染色,可见被染为红色的较标准的脂滴。

    油红O染色试剂盒描述:

         油红O是一种脂溶性重氮染料,用于染色细胞和组织中的脂质和脂肪沉积物。虽然样品可能是新鲜的,冷冻的或福尔马林固定的,但油红O与石蜡包埋的组织切片不相容。观察油红O沉淀是正常的。因此,必须使用Whatman纸或注射器驱动的过滤器单元通过过滤新鲜制备工作溶液。



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    2.成骨诱导分化

    细胞汇合度约达 70%时,加入间质干细胞成骨诱导液,诱导 21 天可见钙结质,进行茜素红染色鉴定, 茜素红与类骨质结合,形成同心圆状的深红色小结节。

    茜素红S染色试剂盒描述:

    茜素红S (Alizarin Red S,简称ARS )作为一种染料型配位剂在分光光度分析方面已有了广泛的应用。近年来,很多作者把 ARS 及其金属配位物在汞电极上的吸附催化波用于电分析中,提高了测定的灵敏度和选择性。


    3.成软骨细胞分化

    细胞汇合度约达 70%时,加入间质干细胞成骨诱导液诱导 21 d 后,使用甲苯胺蓝染色可见较广泛的细胞外基质蓝紫色,尤其在细胞堆积区,图中为细胞密度稍低的区域也可见明显的异染颗粒。

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    阿利新蓝染色试剂盒描述:

      阿尔辛蓝是一种用于检测细胞软骨形成的染料,它可以染色软骨组织中的硫酸化蛋白多糖。阿尔辛蓝染色试剂盒含有1%的阿尔辛蓝溶液,0.1%的核固红,方便,即用型溶液。在pH 2.5时,阿尔辛蓝染色酸性粘多糖并显示蓝色,而核固红染色核粉红色至红色,细胞质淡粉红色。

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    表面分子流式检测

    CD29:来源  THermoFisher      PE

    CD90:来源  THermoFisher      PE

    CD45:来源  THermoFisher     FITC


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