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    如何进行蛋白样品的制备?要注意些什么?

    发布时间: 2022-02-15  点击次数: 589次

    蛋白样品的制备是蛋白质组研究的第一步,无论后续采用怎样的分离或鉴定手段,样品制备都是关键步骤。因此,为了完全分析所有的细胞内蛋白,组织与细胞必须进行有效的破碎。本文在此介绍几种较为常见的方法。


    变性条件——SDS LB直接裂解:

    用常温或者高温预热过(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化,但容易遗忘,而LB久煮会改变某些性质)的1*SDS LB(或者略高1.5*)直接加到细胞或者组织上并煮样。


    通常6孔板细胞80%以上密度,需200ul,其他按平板面积比类推。通常条件下,SDS LB都是过量的(因此不一定要严格参考SDS LB稀释比);如果SDS LB不够,样品核酸、蛋白浓度过高时,煮样后会发现tip吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住tip。

    这时候常规做法有两种:

    1.再煮5min。常规煮样时间3-5min,样品过浓时就煮10min;

    2.如果10min煮样后,仍然吸不起来,才适当增加SDS LB,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若过长,蛋白会凝固,此时以失去继续WB的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀和水分层)


    此方法的缺点是:SDS LB煮过的样品如果用来做IP,需要特殊方法,因此,这种制备方法制备的样品有使用局限。

    非变性裂解法:

    裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用。

    裂解液配方是:20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)(此裂解液可用于抽提核蛋白),其中蛋白酶抑制剂可用0.5mMPMSF替代;如果还要做磷酸化蛋白,加1mM Na3VO4(现加现用),10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP。


    此方法的优点:NaCl浓度略低于生理状态,保证裂解细胞的方式较为温和,便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见,诸如0.15M(生理盐浓度)、0.3M、0.6M(高盐系列,裂解细胞时染色体会析出,细胞碎片和沉淀非常粘稠)及0.8-1.2M;0.3M及以下适合 IP试验,0.6M及以上适合纯化蛋白,尤其相互作用较强的复合体,要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用(木及)端的高盐裂解细胞。

    组织块裂解:

    组织块较大用匀浆的方法最合适,现在有不少转头很小的匀浆器。

    当组织超微量的时候,比如50mg新鲜癌组织,建议采用的方法是

    1. 低温(剪)搅碎,成肉糜状。

    2. 锡箔纸包裹好,放入少量液氮,快速敲击(控制力量,尽量避免弄破锡箔纸),进一步破碎;反复多次。

    3. 用上述细胞裂解液回收。

    分泌型蛋白富集:

    用无血清培养基培养细胞,收集上清液用于WB检测;如果含量过低,需要用TCA沉淀富集。


    理论上,从普通培养基中收集分泌蛋白,此时对细胞生长条件的影响最小,是最佳的实验条件;但是这存在隐忧。因为含血清的培养基中含有非常丰富的BSA(牛血清白蛋白)之类的蛋白质,除非你进一步分离纯化,否则直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦,尤其当你的蛋白在60-46kDa之间的时候;用“任何"抗体去检测这一区间的蛋白,都会有一片非常强的信号。因为此区间蛋白(主要是BSA)浓度过于富集,会非特异性粘附“任意"抗体,从而最终被识别。同理,采用SDS LB裂解细胞制备样品前,通常要用PBS洗涤,其目的之一是去除培养基中的BSA。


    采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外(可能激活未知信号途径,诸如AKT等),还会出现的问题是:

    1. 即使采用了无血清收集上清,仍然有大量杂蛋白,但相对好很多。

    2. 选用了上清,由于蛋白浓度太稀,通常要采用TCA沉淀富集,再重新溶解。

    a. TCA沉淀对半定量操作要求非常高,因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失,尤其在离心过程,离心管的摆放非常讲究,要180度翻转离心两次。

    b。重新溶解时,由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解,你要摸索充分溶解的条件,相对麻烦。


    实际上,如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能,一般不建议检测上清,尤其半定量的WB实验检测不同样品间的差异。

    注意事项
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    样品制备完,应立即低温保存【-20度短期(几天)-80度长期;例如,IP用样品应直接进行IP,避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用】。SDS LB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题,SDS沉淀;SDS在4度就会沉淀,何况-80度。上样前应加热充分溶解,否则从加样口向下拖带(SDS LB不够,样品未充分溶解也会出现类似拖尾;上样过大也会)。

     

    在样品制备过程中,另一个需要注意的问题是从样品制备的起始阶段就要注意定量问题;WB本身系统误差有20%,太细微的差别经常忽略不计。细胞样品可以先计数再接种,短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品,从肿瘤组织的大小(称重)开始,裂解液的体积都是精确定量的,操作过程也 尽量避免蛋白损失。


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