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    细胞转染技术原理及应用(瞬时转染和稳定转染)

    发布时间: 2022-03-14  点击次数: 534次

    常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永(jiu)转染)。前者外源DNA/RNA 不整合到宿主 染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它 调控元件的分析。

    一般来说,超螺旋质粒DNA 转染效率较高,在转染后24-72 小时内(依赖于各种不同的构建)分 析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β 半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA 既可以整 合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。

    尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。 外源DNA 整合到染色体中概率很小,大约1/104 转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移 酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B 磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细 胞系。

    转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA 与转染 试剂 比例,细胞数量,培养及检测 时间等。一些传统的转染技术,如DEAE 右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应 用特点见下表:

    (各种转染方法的比较) 除上述传统方法外,近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便对 细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。

    聚乙烯亚胺是一种具有较 高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合 物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵"(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种 属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。大量 实验证明,PEI 是非常有希望的基因治疗载体。

    目前在设计更复杂的基因载体时,PEI 经常做为核心组成成分。线 型PEI(Line PEI,LPEI)与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI(Branched PEI,BPEI)要早一些,过 去的研究认为在不考虑具体条件,LPEI/DNA 转染复合物的细胞毒性较低,有利于细胞定位,因此与BPEI 相比应该 转染效率高一些。

    但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率,但同时细胞 毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI 衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基,在染实验中发现这种PEI 的毒性低, 但转染效率却较高。



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