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    细胞冻存保种

    发布时间: 2022-10-18  点击次数: 264次


    细胞生长至对数中晚期,以培养基制备高浓度细胞悬液,加入细胞保护剂,等份转移至冻存管中,缓慢冷冻。

    市场上有多家成熟的无血清冻存液,这些试剂简单实用,极其便捷。对一些难复苏的细胞极其友好。但是对于长期的细胞留库保种还是建议采用传统的方法。

    两种冻存液比较
    方法优点缺点

    传统DMSO/甘油冻存法  

     能较好的维持细胞的特性 一些细胞冻存效果不佳

    无血清无蛋白冻存法

    使用方便,对新手友善

    同样含有DMSO,某些敏感细胞慎用

     


    原理


    传统上的细胞冻存(甘油/二甲基亚砜做保护剂)讲求的是:慢冻速溶。细胞冻存时向培养基中加入的甘油或二甲基亚砜(DMSO),这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

     


    用途


    细胞保种


    材料与仪器


    【实验材料】细胞、DMSO、0.25% Trypsin-EDTA(或细胞刮刀)、100 X双抗、PBS、胎牛血清、DMEM *培养基、75% 乙醇、胰酶、异丙醇;

    【仪器与用品】冻存管、37度恒温水浴锅、培养皿(6 cm)、细胞冻存盒(已添加异丙醇)或冻存泡沫盒、记号笔、-80度冰箱、倒置相差显微镜、冻存管、37度恒温水浴锅、培养皿(6cm)、液氮罐、离心机、细胞房专用超净台、移液枪及移液枪头(无菌或灭菌后烘干)、一次性细胞计数板、细胞自动计数仪、培养箱、移液管。


    步骤


     1.  预先配制冻存液:按正常培养基:DMSO =9:1比列配制冻存液;

    2.  取对数生长期细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,离心1000 rpm,5 min;

    3.  去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/mL~1×107/mL;

    4.  将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;

    5.  在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间、细胞代数及操作者;

    6.     往冻存盒中加入异丙醇(在负八十冰箱中能以1℃/min的速度下降)放入负八十冰箱即可,建议12小时以上,一般可在负八十中保存半年至一年,长期保存要转移至液氮中;商用冻存液可以直接冻存管放负八十冰箱。

     


    注意事项


    1、液氮冻存不建议用国产冻存管,复苏时容易爆管;

    2、消化细胞时,不能过度消化;

    3、DMSO溶于DMEM培养基会放热,应提前5-10分钟配置冻存液。用冻存盒时避免异丙醇将标记擦掉;

    4、二甲基亚砜能穿透许多合成的或天然的膜,包括皮肤和橡胶手套。因此,应谨慎处理。将冻存管放入液氮时,必须使用保护性手套和面罩。


    常见问题


    1、细胞消化过度,导致复苏时细胞状态不好;

    2、负八十冰箱中长期保存细胞效果不好,应及时将细胞转移至液氮中;

    3、国产冻存管在液氮中容易漏液氮,导致复苏时曝管,所以放液氮中尽量使用质量较好的冻存管。


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