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    细胞周期检测(流式细胞术)

    发布时间: 2022-10-18  点击次数: 307次

    原理


    流式细胞周期检测是一种常见的检测细胞增殖情况的方法之一,细胞在不同周期时,其内的DNA含量不同。碘化丙啶(PI)作为一种核酸嵌入型染料,能够进入固定后的细胞中,与细胞内的核酸结合,其荧光强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪检测不同细胞中的荧光强度,从而判定不同组别中细胞周期发生的变化。


    用途


    检测不同组别或处理对某种细胞周期的改变。


    材料与仪器


    【器材】
    流式细胞仪、移液器、枪头、离心管、离心机、流式细胞仪、水浴锅、流式管、滤头;
    【试剂】0.25% 胰蛋白酶溶液、PBS、RNA酶、PI染液、70% 乙醇溶液(建议提前放入负二十预冷);


    步骤


    1.以肿瘤细胞为例,将正常生长的对照或处理组肿瘤细胞计数,每组取2×105-3×105个细胞铺板,待细胞贴壁后,将正常培养基替换为无血清1640培养基,同步化20 h,使得所有细胞都进入相同的细胞周期时期;同步完后,将培养基重新替换为正常含血清培养基,继续培养24 h;
     
    2.用不含EDTA的胰酶将细胞消化,收集细胞,300 g,离心3 min;用吸引器去除培养基,用PBS清洗细胞一次,再次300 g,离心3 min;去除PBS,用提前预冷的70%酒精重悬细胞沉淀,4℃固定过夜;
     
    3.4℃,1000 g,离心3-5 min,去除酒精,用PBS清洗3遍,最后一遍去除PBS;加入300 μL PBS,轻轻吹打,重悬细胞沉淀,加入相应量的Rnase至终浓度100 μg/mL,37 ℃水浴锅中消化30 min;
     
    4.上机前加入PI(5 mg/mL)至终浓度50 μg/mL,避光孵育15 min;孵育完后,过300目细胞筛,上机检测;
     
    5.分析数据。
      


    注意事项


    1. PI为致癌物质,避免用手直接接触。

    2. 细胞数目应该达到2x104个,细胞数目过少影响实验结果的准确性。
     
    3.铺板的细胞数量以收获细胞时有足够的生长空间来动态调节,现在的流式细胞仪灵敏度很高,不需要太多的细胞。
     
    4. 在制备时,要清洗干净酒精,特别注意清洗过程中细胞的损失。离心次数不宜过多,防止细胞丢失。
     
    5. 可以用未处理的细胞调试流式细胞仪。
     
    6.胰酶不加EDTA

     


    常见问题


    Q:酒精固定后细胞难以沉淀下来,导致细胞丢失较多;

    A:可适当延长离心时间和转速。


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