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    细胞毒性分析

    发布时间: 2022-10-20  点击次数: 190次


    细胞毒性是指由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件,不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。 常用细胞毒性检测方法有CCK-8法、MTT法、LDH法。

    1、与MTT法相比:

    1)CCK-8使用更为方便,无需洗涤细胞;
    2)CCK-8法能快速检测;CCK-8法的检测线性范围广,灵敏度更高;
    4)CCK-8法的重复性更好,MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的,需要使用DMSO 等有机溶剂溶解;CCK-8法产生的formazan 是水溶性的,既省去了溶解步骤,又可以减少该操作步骤带来的误差;
    5)CCK-8法对细胞毒性小,可以保持细胞原状态;CCK-8法试剂价格较高;

    2、与LDH法相比:

    1)CCK-8是加在细胞中,而LDH检测是细胞上清,这样细胞还可以用来做其他实验;
    2)LDH法可进行高通量检测;

     


    原理


    以CCK-8法为例简述其原理:CCK-8试剂盒中含水溶性四唑盐WST-8 (化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),WST-8在电子载体1-Methoxy PMS存在的条件下,活细胞线粒体中的脱氢酶催化WST-8生成高度水溶性的橙黄色甲瓒燃料,而甲臜染料的生成量与活细胞的数量成线性关系。


    用途


    1、药物筛选实验;
    2、肿瘤药敏试验;
    3、生物活性因子的活性检测;
    4、细胞增殖测定等;


    材料与仪器


    【材料】细胞悬液,化合物溶液、CCK8试剂、*培养基、PBS、0.25%Trypsin-EDTA

    【仪器,耗材】96孔板,二氧化碳培养箱,检测波长450-490nm酶标仪


    步骤


    1、根据具体细胞类型确定其在 96 孔板种植密度,以对照组细胞密度至检测时达到 70%-90%为参照,每组设置 3-6 个复孔,孔板边缘空不用,加入与培养基等体积的无菌 PBS 溶液;

    2. 每孔加入培养基体积 1/10的CCK-8 溶液。若起始的培养体积为 200 微升,则需加入 20 微升 CCK-8 溶液,其它情况以此类推。同时以加了相同体积细胞培养液和 CCK-8 溶液但没有细胞的孔作为空白对照。若所用药物会干扰检测结果,则选加入等体积细胞培养液、药物和CCK-8溶液但无细胞的孔作为空白对照(注意不可产生气泡);

    3. 在细胞培养箱内继续孵育 2-4 小时,建议选取2、3、4小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验;

    4. 在 450 nm测定吸光度。如无 450 nm滤光片,可以使用 420-480 nm的滤光片。可以使用大于 600 nm的波长,例如 650 nm,作为参考波长进行双波长测定。


    注意事项


    1、本实验使用96孔板进行检测,周围一圈最容易蒸发,检测会因体积不准确而增加误差故弃用周围一圈,加入等体积相同量的PBS、水或培养液;

    2、本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,因而还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。

    3、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定;

    4、酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去;

    5、试剂有一定的毒性,请穿好实验服并戴一次性手套操作;

    6、试剂要注意避光4oC或-20oC保存;


    常见问题


    1. 如果细胞生长较慢,且细胞较小,可以最大接种1x10^4 cells/well,但加入化合物后处理时间最长为72 h。

    2. 化合物如果难溶于水,可以在培养基中适当添加DMSO、DMF以助溶,但最大浓度不宜超过0.5%,因为DMSO和DMF对细胞也有一定的毒性。如果使用DMSO、DMF助溶,需保证其他浓度的化合物DMSO、DMF的浓度也相同。

    3.若吸光度值太低,怎么办法?
    1)适当增加细胞数量;
    2)延长加入CCK-8溶液后的孵育时间



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