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    冷胰蛋白酶解离组织

    发布时间: 2022-12-09  点击次数: 176次

    原理

    剪碎的组织放在胰蛋白酶中于4°C 放置16~18h ,去除胰蛋白酶后温育并于温培养基中分散细胞。

    材料与仪器

    组织 DBSS 粗制胰蛋白酶
    生长培养基 皮氏平皿
    培养瓶 镊子 移液管 锥形瓶 剪刀 冰浴

    步骤

    1. 将组织(1~5 g,预先称重)移入加有新配制的无菌 DBSS 的皮氏培养皿中,清洗。

    2. 转入另一培养皿中,切除多余组织如脂肪和坏死组织。

    3. 转入第三个培养皿中,用交叉的手术刀细切成大约 3 mm3 的小块。胚胎的器官若小于 3 mm3 ,可全部保留。

    4. 用弯镊子将组织块移入一个预称重的 15 ml 或 50 ml 无菌离心管内。

    5. 让组织块沉降。

    6. 用 DBSS 重悬清洗组织块,沉降后去除上清,重复此步骤两次以上。

    7. 小心去除剩余液体,预先称重。

    8. 每克组织加入 10 ml 溶于 RPMI1640 或 S-MEM 的 0.25 % 胰蛋白酶(0.25 粗制胰蛋白酶溶于无血清的 RPMI1640或 MEM/Stirrer salt (S~MEM ) 中),置于 4°C 。

    9. 4°C 放置 6~18 h 。

    10. 小心吸去胰蛋白酶,余下组织及残余胰蛋白酶(若需要,此时可加人 1~2 ml 其他酶,如胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶等)。

    11. 37°C 放置 20~30 min 。

    12. 加入温培养基,大约每 100 mg 初始的组织加 1 ml,轻轻上下吸打混合物至组织完-全分散开。

    13. 若部分组织未分散,细胞悬液可用无菌的平纹纱布或不锈钢筛(100~200 μm ),或一次性使用的塑料筛滤网过滤细胞,或者让大的组织块沉降。当有较多组织时,可于每克组织中多加入 20 ml 培养基促进沉淀和随后的悬液收集,通常 2~3 min 就足以去除大多数的大块组织。

    14. 用血球计数板或电子计数仪测定悬液的细胞密度,检査活细胞比率。

    15. 细胞群体为异源性,由于校准口径较困难,因而初次使用电子计数仪时,需要用血球计数板来确认。

    16. 将细胞悬液生长培养基(生长培养基(如DMEM/F12,含10% 胎牛血清))稀释,使每毫升培养基含有 1×106 个细胞。按照需求接种于多个培养瓶(25 cm2、75cm2 培养瓶)中,大约每平方厘米为 2×105 个细胞。当存活率不明确或难以预知时,细胞计数便无价值(如肿瘤活检时,死亡细胞的比例很高)。在这种情况下,建议按每毫升 5~25 mg 组织的浓度接种。

    17. 间隔一定时间更换一次培养基(2~4 天,以 pH 下降为标准)。由于部分细胞黏附较慢甚至易于悬浮生长,所以丢弃上清前要先检査上清液中是否有存活的细胞。

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