蛋白酶活性检测方法

1 定义

1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和PH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/ mL)表示。

2 福林法(第一法)

2、1 原理

蛋白酶在一珲的温度与PH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。

2、2 试剂和溶液

2、2、1 福林试剂的制备

于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50g、水50mL和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，见水定溶至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

2、2、2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L

称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三录乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L

称取三录乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L

按GB601配制。

2、2、5 盐酸溶液c(HCI)=1 mol/L及0.1 mol/L

按GB601配制。

2、2、6 缓冲溶液

a、磷酸缓冲液 (PH=7.5)适用于中性蛋白酶

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液(PH=3.0)适用于酸性蛋白酶

甲液 称取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液 称取乳酸钠(70%)16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液 取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c、硼酸缓冲溶液(PH=10.5)适用于碱性蛋白酶

甲液 称取硼酸钠(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。

上述各种缓冲溶液，均须用PH计校正。

2、2、7 10g/L酪素3)溶液

称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜PH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中

边加热边搅拌，直到全部溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的PH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

注：3)酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。

2、2、8 100ug/mL L-酪氨酸4)标准溶液

a、称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/ mL酪氨酸标准溶液。

注：4)L-酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。

b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L-酪氨酸标准溶液。

2、3 仪器和设备

2、3、1 恒温水浴 40±0.2℃。

2、3、2 分光光度计 应符合GB9721的规定。

2、4 分析步骤

2、4、1 标准曲线的绘制

a、L-酪氨酸标准溶液

按表3配制

表3 

     、b、分别取上述溶液各1.00 mL(须做平等试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00 mL、福林试剂使用溶液1.00 mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。

根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。

2、4、2 测定

待测酶液的制备

a、称取酶粉1～2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00 mL)，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.25～0.40范围内)。

b、酶粉测定时，稀释倍数参考表A4(液体酶亦可参照表A4稀释)。

表A4

测定

a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min;

b、按下列程序操作：

试管A(空白) 试管B(酶试样，需作三个平行试样)

加酶液1.00 mL 加酶液1.00 mL

40±0.2℃，2min

加三录乙酸2.00 mL(摇匀) 加酪素1.00mL(摇匀)

40±0.2℃，10min 40±0.2℃，10min

加酪素1.00(摇匀) 加三录乙酸2.00mL(摇匀)

取出静止10min，过滤 取出静止10min，过滤

取1.00mL滤液 取1.00mL滤液

加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL

加福林试剂使用液1.00mL 加福林试剂使用液1.00mL

40±0.2℃ 显色20min 40±0.2℃ 显色20min

于680nm波长，用10mm比色皿 于680nm波长，用10mm比色皿

测其吸光度 测其吸光度

c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4、2(2)。标准曲线作同样处理。

5 计算

X=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n…………………(A3)

式中：X——样品的酶活力，u/g(u/mL);

A——样品平行试验的平均吸光度;

K——吸光常数;

4——反应试剂的总体积，mL;

10——反应时间10min，以1min计;

n——稀释倍数。

所得结果表示至整数。

6 结果的允许差

平行试验相对误差不得超过3%。

紫外分光光度法(第二法)

1 原理

蛋白酶在一定的温度与PH条件下，水解酪素底物，然后加入三录乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。

2 试剂和溶液

同 2。

3 仪器和设备

3、1 恒温水浴40±0.2℃。

3、2 紫外分光光度计 应符合GB 9721的规定。

4 分析步骤

4、1 求K值

按第一法( 4、1a)的表A3配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A)，并计算K值(其K值应在130～135)范围内)。

4、2 待测酶液的制备

a、称取酶粉1～2g，精确至0.0002g(或吸取酶液1.00 mL),以下操作同A2`4`2中(1)a;

b、测定酶粉时稀释倍数参考表A5(液体酶亦可参照表A5稀释)。

表A5

、4、3 测定

除酶液吸取2.00mL、酪素吸取2.00mL、三录乙酸吸取4.00 mL外，其它操作条件同福林法测定( 4、2)中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度(A)。

5 计算

X=A×K×8/2×1/10×n=2/5×A×K×n×E…………………(A4)

式中：X——样品的酶活力，u/g(u/mL);

A——试样溶液的平均吸光度;

K——吸光常数;

8——反应试剂的总体积，mL;

2——吸取酶液2.00mL，以1min计;

1/10——反应时间10min，以1min计;

n——稀释倍数

E——紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.50;酸性蛋白

酶系数为0.77)。

所得结果表示至整数。

7 结果的允许差

平行试验测定值之差不得超过3

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