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    蛋白酶活性检测方法

    发布时间: 2023-04-19  点击次数: 1897次

    1 定义

    1g固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度和PH值条件下,1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位,以(u/ mL)表示。

    2 福林法(第一法)

    2、1 原理

    蛋白酶在一珲的温度与PH条件下,水解底物,产生含有酚基的氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生成钼蓝与钨蓝,用分光度法测定,计算其酶活力。

    2、2 试剂和溶液

    2、2、1 福林试剂的制备

    于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL,水火沸腾回流10h,取下回流冷却器,在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50g、水50mL和数滴浓溴水(99%),再微沸15min,以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水,再煮沸除去过量的溴),冷却,见水定溶至1000ml。混匀,过滤。制得的试剂应呈金黄色,贮存于棕色瓶内。

    使用溶液:一份福林试剂与二份水混合,摇匀。

    2、2、2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L

    称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,用水溶解并定容至1000 mL。

    2、2、3 三录乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L

    称取三录乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000 mL。

    2、2、4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L

    按GB601配制。

    2、2、5 盐酸溶液c(HCI)=1 mol/L及0.1 mol/L

    按GB601配制。

    2、2、6 缓冲溶液

    a、磷酸缓冲液 (PH=7.5)适用于中性蛋白酶

    称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g,加水溶解并定容至1000mL。

    b、乳酸缓冲液(PH=3.0)适用于酸性蛋白酶

    甲液 称取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000 mL。

    乙液 称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000 mL。

    使用溶液 取甲液8 mL,加乙液1 mL,混匀,稀释一倍,即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

    c、硼酸缓冲溶液(PH=10.5)适用于碱性蛋白酶

    甲液 称取硼酸钠(硼砂)19.08g,加水溶解并定容至1000 mL。

    乙液 称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000 mL。

    使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀,用水稀释至1000mL。

    上述各种缓冲溶液,均须用PH计校正。

    2、2、7 10g/L酪素3)溶液

    称取酪素1.000g,精确至0.001g,用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)湿润后,加入适量的各种适宜PH的缓冲溶液约80 mL,在沸水浴中

    边加热边搅拌,直到全部溶解,冷却后,转入100 mL容量瓶中,用适宜的PH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。

    注:3)酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。

    2、2、8 100ug/mL L-酪氨酸4)标准溶液

    a、称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,精确至0.0002g,用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL,即为1mg/ mL酪氨酸标准溶液。

    注:4)L-酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。

    b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL,用0.1mol/L盐酸定容至100 mL,即得到100ug/ mL L-酪氨酸标准溶液。

    2、3 仪器和设备

    2、3、1 恒温水浴 40±0.2℃。

    2、3、2 分光光度计 应符合GB9721的规定。

    2、4 分析步骤

    2、4、1 标准曲线的绘制

    a、L-酪氨酸标准溶液

    按表3配制

    表3 

     

    管 号
    酪氨酸标准溶液的浓度
    ug/ mL
    取100ug/ mL酪氨酸标准溶液的体积
    mL
    取水的体积
    mL
    0
    0
    0
    10
    1
    10
    1
    9
    2
    20
    2
    8
    3
    30
    3
    7
    4
    40
    4
    6
    5
    50
    5
    5

         、b、分别取上述溶液各1.00 mL(须做平等试验),各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00 mL、福林试剂使用溶液1.00 mL,置于40±0.2℃水浴中显色20min,取出,用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿,以不含酪氨酸的0管为空白,分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线(此线应通过零点)。

    根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug),即为吸光常数K值。其K值应在95~100范围内。

    2、4、2 测定

    待测酶液的制备

    a、称取酶粉1~2g,精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00 mL),用少量该酶的缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,然后将上清液小心倾入容量瓶中,沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,摇匀。用四层纱布过滤,滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度,供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.25~0.40范围内)。

    b、酶粉测定时,稀释倍数参考表A4(液体酶亦可参照表A4稀释)。

    表A4

    酶活单位
    总倍数
    第一次稀释
    第一次稀释
    2万
    2000
    2g 200 mL(100倍)
    5 mL 100 mL(20倍)
    3万
    2500
    2g 500 mL(100倍)
    5 mL 50 mL(10倍)
    4万
    4000
    2g 200 mL(100倍)
    5 mL 200 mL(40倍)
    5万
    5000
    2g 500 mL(100倍)
    5 mL 100 mL(20倍)
    9、10万
    10000
    2g 500 mL(100倍)
    5 mL 200 mL(40倍)

    测定

    a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中,预热5min;

    b、按下列程序操作:

    试管A(空白) 试管B(酶试样,需作三个平行试样)

    加酶液1.00 mL 加酶液1.00 mL

    40±0.2℃,2min

    加三录乙酸2.00 mL(摇匀) 加酪素1.00mL(摇匀)

    40±0.2℃,10min 40±0.2℃,10min

    加酪素1.00(摇匀) 加三录乙酸2.00mL(摇匀)

    取出静止10min,过滤 取出静止10min,过滤

    取1.00mL滤液 取1.00mL滤液

    加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL

    加福林试剂使用液1.00mL 加福林试剂使用液1.00mL

    40±0.2℃ 显色20min 40±0.2℃ 显色20min

    于680nm波长,用10mm比色皿 于680nm波长,用10mm比色皿

    测其吸光度 测其吸光度

    c、1.398和166蛋白酶,除反应与显色温度为30±0.2℃外,其它操作同 4、2(2)。标准曲线作同样处理。

    5 计算

    X=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n…………………(A3)

    式中:X——样品的酶活力,u/g(u/mL);

    A——样品平行试验的平均吸光度;

    K——吸光常数;

    4——反应试剂的总体积,mL;

    10——反应时间10min,以1min计;

    n——稀释倍数。

    所得结果表示至整数。

    6 结果的允许差

    平行试验相对误差不得超过3%。

    紫外分光光度法(第二法)

    1 原理

    蛋白酶在一定的温度与PH条件下,水解酪素底物,然后加入三录乙酸终止酶反应,并使未水解的酪素沉淀除去,滤液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。

    2 试剂和溶液

    同 2。

    3 仪器和设备

    3、1 恒温水浴40±0.2℃。

    3、2 紫外分光光度计 应符合GB 9721的规定。

    4 分析步骤

    4、1 求K值

    按第一法( 4、1a)的表A3配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液,然后,直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A),并计算K值(其K值应在130~135)范围内)。

    4、2 待测酶液的制备

    a、称取酶粉1~2g,精确至0.0002g(或吸取酶液1.00 mL),以下操作同A2`4`2中(1)a;

    b、测定酶粉时稀释倍数参考表A5(液体酶亦可参照表A5稀释)。

    表A5

    酶活单位
    总倍数
    第一次稀释
    第二次稀释
    2~5万
    8~10万
    2000
    4000
    1g 200mL(200倍)
    1g 200mL(200倍)
    10mL 100mL(10倍)
    5mL 100mL(20倍)

    、4、3 测定

    除酶液吸取2.00mL、酪素吸取2.00mL、三录乙酸吸取4.00 mL外,其它操作条件同福林法测定( 4、2)中的反应、静止沉淀,直到过滤。滤液用紫外分光光度计,在275nm波长下,用10mm比色皿,测定其吸光度(A)。

    5 计算

    X=A×K×8/2×1/10×n=2/5×A×K×n×E…………………(A4)

    式中:X——样品的酶活力,u/g(u/mL);

    A——试样溶液的平均吸光度;

    K——吸光常数;

    8——反应试剂的总体积,mL;

    2——吸取酶液2.00mL,以1min计;

    1/10——反应时间10min,以1min计;

    n——稀释倍数

    E——紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.50;酸性蛋白

    酶系数为0.77)。

    所得结果表示至整数。

    7 结果的允许差

    平行试验测定值之差不得超过3


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