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    单链 cDNA 的合成

    发布时间: 2023-04-21  点击次数: 427次

    材料与仪器

    步骤

    一、材料

    1. 缓冲液、溶液和试剂

    去除 RNA 酶的双蒸水

    10XRT-PCR 缓冲液(去除 RNA 酶的双蒸水,100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)

    2. 酶和酶缓冲液

    MMLV 逆转录酶(100~200U/ul)

    SUPERaseINRNA 酶抑制剂(20U/ul;Ambion)

    3. 核酸和寡核苷酸

    dNTP 混合物(10 mmol/L,包含所有四种 dNTP)

    随机引物(5umol/L)

    总 RNA(达到 2.5ug)

    4. 实验器材

    薄壁的 PCR 管

    二、方法

    1. 在冰上加 2ul50umol/L 的随机引物到薄壁的 PCR 管中(一个反应一管)。

    2. 加入 2.5ug 的总 RNA。

    3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。

    4. 添加去除 RNA 酶的双蒸水(RNaSe-freeH20),使体积达到 16ul。

    5.70°C 加热 10min, 变性二级结构,然后立即放在冰上。

    6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 缓冲液。

    7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。

    8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆转录酶。

    9.42°C 温浴 1h。

    10.95°C 加热10min, 灭活逆转录酶。

    11. 继续扩增步骤或停止反应,-2°C 储存。


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