销售热线

19126518388
  • 技术文章ARTICLE

    您当前的位置:首页 > 技术文章 > 构建载体

    构建载体

    发布时间: 2023-05-05  点击次数: 681次

    构建载体最关键的一步就是设计引物引入酶切位点,一旦引物设计好,那接下来就非常简单了,今天重点就来教教大家如何利用 snapgene 轻松获得构建载体所需的引物序列。


    1. 打开软件,选择第一个(红线标记),然后输入基因的 CCDS 序列(基因的 CCDS 序列可在 NCBI 数据库中获得)。


    2.点击 ok 后界面,图中显示的是会切割基因编码序列的酶


    3. 接下来点击最上面的 Enzymes Noncutters,会显示所有不会切割基因编码序列的酶,这些酶都是我们可以用的,选酶的标准:要选择不能切割目的基因序列并且质粒上含有的酶,还有就是最好是实验室有的酶。


    4. 确定了可以用的酶后,接下来需要确定设计引物时用的这两种酶,确定方法:这两种酶最好不要邻近,最好使用双酶切有共同 buffer 的酶,两个酶切位点最好不要是同尾酶(切下来的残基不要互补),否则效果相当于单酶切。


    5. 确定了所要用的酶之后,接下来需要做的就是设计引物并引入酶切位点(注意:一定要看清楚载体上 promoter 的方向,将 CDS 正向插入到 promoter 后面)。


    6. 点击左下角的 sequence,然后拉取上游一部分基因本身的序列,拉取的时候会显示拉取的碱基的个数以及 Tm 值,拉取到 Tm 值 55 度左右就可以(55 度以上最好)。


    7. 然后点击 primer——add primer,选择 top strand。


    8. 点击 insertions,在 site 位置处选择你准备引入的酶,比如我要引入 EcoR I,那我就选择它,然后点击 insert,这样我们就引入了该酶的酶切位点。


    9. 接下来需要添加保护碱基,所有的酶的保护碱基都加三个,哪个碱基没有要求,使 GC 含量及 Tm 值适中即可。


    10. 这样上游引物就设计好了,接下来需要检测一下引物是否会形成发卡结构,可以应用OligoCalc,如果发现会形成发卡结构,那就需要对引物序列做出一些调整,直到发卡结构消失。


    11. 接下来拉取基因的下游的一部分序列,用同样的方法设计好下游引物,有一点需要注意的是,设计下游引物的时候选择 bottom strand。


    这样构建载体所需的引物就设计好了,怎么样,是不是感觉其实也没有那么难,接下来就可以构建属于你自己的载体了。


    深圳安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技术实力、壹流的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东,服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司,旨在为生命科学的发展提供壹流的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线,在各个领域内向用户提供世界前沿水平和质量稳定的产品,安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等优质客户提供优质的产品、技术支持与服务。






产品中心 Products