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    分子克隆实验的注意事项和经验分享

    发布时间: 2024-01-16  点击次数: 347次

    简介:

     分子克隆(基因克隆/DNA重组/载体构建)技术是一种在分子水平上操作的技术,用于将特定的DNA片段从供体生物中分离出来,然后通过体外重组、转化和转导等方法,将其插入到适合的克隆载体中,并将重组克隆载体引入到合适的寄主体内进行复制与扩增。可以应用于蛋白表达、病毒包装、基因治疗、细胞治疗、mRNA疫苗、RNA干扰、细胞功能等研究。


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    具体操作流程:

    一、聚合酶链式反应(PCR)

    DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3'-OH末端,并以此为起始点, 沿模板5'→3'方向延伸,合成一条新的DNA互补链。

    (1)PCR反应基本成分:

    ①模板DNA

    基因组DNA上的某个基因或DNA片段;也可以是mRNA反转录产生的cDNA链。
    ②引物
    先由引发酶(一种特殊的RNA聚合酶)在DNA模板上合成一段RNA链,它提供引发末端被称为引物,接着由DNA聚合酶从RNA引物3^端开始合成新链。
    ③dNTPs
    (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) 是PCR反应中靶DNA序列扩增的原料。在PCR反应中每种脱氧核苷三磷酸的浓度以50-200μmol/L为宜, 不能低于10-15μmol/L。
    ④DNA聚合酶
    该片段具有聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性, 能识别和消除错配的引物末端, 以校正复制过程中错配的核苷酸。
    通过双链DNA的高温变性 (denaturation),目的是要使双链DNA解链成单链。引物与模板的低温退火 (annealing) ,作用是使模板DNA单链或上一轮的反应产物与引物相结合。适温延伸 (extension),引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物3'-OH末端, 依据模板序列合成一条互补新链的过程。这三步反应反复循环。每一循环中所合成的新链, 又都可作为下一循环中的模板。
    (2)反应体系(50ul体系)
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    (3)反应程序:
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    二、线性化载体

    在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切,对酶切后的载体进行割胶纯化。
    环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型:
    ①当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共价闭合环形DNA(cccDNA),这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型;
    ②如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构,另一条链出现有一至数个缺口时,称之为开环DNA(ocDNA),此即OC构型;
    ③若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后,发生双链断裂形成线性分子(IDNA),通称L构型。
    线性化之后的质粒比正常质粒在琼脂糖凝胶电泳中跑的慢。


    三、纯化PCR、酶切产物并连接

    将反应结束的产物进行纯化,纯化所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好,目前有多种试剂盒可供选择;

    连接线性化载体和PCR产物,可根据DNA连接酶试剂盒说明书设置,对于较大的片段可以选择4℃连接过夜。


    四、细菌转化

    冰上解冻克隆感受态细胞(DH5α);取重组产物,加至感受态细胞中,冰上静置30min,42℃水浴热激45s,迅速置于冰上2-3min;加入600μL LB液体培养基,37℃摇菌1h。


    五、菌落PCR
    用灭过菌的 10ul 小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中,振荡混匀。然后用正常的 PCR 反应程序可。

    PCR正常反应结束后用琼脂糖凝胶电泳进行检测,选择正确条带的菌液加入对应的培养基,37℃摇起来。


    注意事项

    聚合酶链式反应
    ①所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
    ②PCR 试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水。
    ③试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
    ④PCR 的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。
    质粒转化
    ①冰上解冻感受态细胞:大肠杆菌经过低温(0度)预处理的低渗cacl2溶液,造成细胞膨胀,细胞膜通透性发生改变,即易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物。
    ②热激转化利用氯化钙来产生富含钙离子的环境,从而抵消质粒DNA和细菌细胞膜之间的静电排斥。温度的急剧提高可以在细菌胞膜表面形成小孔,质粒DNA就可进入细菌细胞。
    菌落PCR
    ①在做菌落 PCR 的时候,每次都要做阴性、阳性对照,阳性对照可以用抽提好的质粒或基因组,这样可以确定 PCR 主反应液的配制没有问题。

    ②菌落PCR反应程序变性94℃4-5min即可保证外源DNA释放出来。

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