CO-IP实验操作及注意事项

原理：

 CO-IP（免疫共沉淀）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

 从原理示意图可见，免疫共沉淀利用抗原（红三角）与蛋白 (蓝圆柱) 的特异性结合，再通过连接着树脂的抗体 (紫圆球) 去识别抗原，从细胞裂解液或者蛋白混合物中捕获与抗原相作的蛋白。之后通过进一步洗脱，获取抗原-蛋白复合物，再对蛋白进行检测。

一、蛋白样品制备

裂解提取出免疫沉淀需要的蛋白样品，以下为HEK293T细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、收集细胞：10cm细胞培养板上，每板细胞加1ml ，4℃预冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。反复冲洗把所有挂壁细胞洗下来转移到1.5ml离心管内 离心：3400 rpm 2min。

2、清洗细胞：弃上清，（大枪头套小枪头）避免吸到沉淀。再加1mPBS，垂悬吹打；离心：rpm3400 2min。弃上清，将PBS吸净后-80℃保存。

3、准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

4、裂解蛋白，收集的细胞中加入1000ul细胞裂解液10ul蛋白酶抑制剂，冰上静置30min，每10min震荡混匀一次，4℃，12000rpm离心10min，收集上清液。

5、 每1 ml 总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃1 h以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

6、4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中标号Input，留Protein A珠子，标号IP。

7、变性以及还原蛋白

室温溶解蛋白上样缓冲液（5×），按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合，IP组加入50ul蛋白上样缓冲液，在蛋白样品中加入含SDS（保证样品中的所有蛋白带电荷一致）的上样缓冲液，100℃加热煮沸，以充分变性蛋白。冰上骤冷，上样到SDS-PAGE胶加样孔即可。

二、经过SDS-PAGE分离样品

胶的选择与制备（根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶的浓度）

1、凝胶的制备:根据目的蛋白的大小来选择合适浓度的分离胶。目的蛋白小于20 k Da选择12%~15%的分离胶;大于20 k Da选择10%的分离胶, 浓缩胶一般固定为5%。

2、上样加入蛋白样品，每孔加上样液20ug，留一孔加预染的marker。

3、加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70V恒压电泳，约30min,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用90V恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。

（注意：上样时间尽量短，避免样品扩散，但也不能过快避免样品溢出而造成相邻加样孔的交叉污染，未加样的孔中加入等量的样品缓冲液）

三、转膜、封闭、一抗、二抗孵育

将蛋白凝胶中的蛋白，通过电流作用转移到转印膜上。

1、将剪好的PVDF膜用无水甲醇润湿30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作。

2、装配转膜三明治结构（在转移缓冲液中制备三明治可以避免气泡的产生）

黑面（负极）→海绵垫→3层滤纸→凝胶→转印膜→3层滤纸→海绵垫→红面（正极），每层之间不能有气泡。然后将三明治转移至电泳槽中，黑面对黑面。

3、加入转膜缓冲液，将电转仪置于冰水中，300mA恒流转膜60-90min。

4、转膜结束后，使用5% 脱脂奶粉室温封闭1h。

5、选择合适的一抗孵育，室温摇动1h。

6、孵育二抗，4℃孵育2h或室温（22-25℃）摇动孵育1h。（抗体查相应说明书确定稀释倍数）

四、显影

1、配置稀释液，将A液和B液按照（1：1）混合。

2、从TBST缓冲液中取出膜，去除膜上的多余缓冲液，但不要让膜干燥。

3、将有蛋白的一面朝上平整的铺在一张纸板上，加上配好的工作稀释液。用量以覆盖住膜为基准。

4、将膜与工作稀释液孵育1-5min,确保整个表面覆盖。

5、去除多余的液体，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中X胶片感光显影定影。

注意：

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入 H2O2。

3、DAB 有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

五、注意事项

1、上样时，要迅速，避免样品扩散，也不能让样品溢出而造成相邻加样孔的交叉污染。

2、全程操作中戴手套，不要用手触膜。

3、如检测小于20kD的蛋白应用0.2µm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。

4、 某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。

5、如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。

6、曝光时。去除膜上的多余缓冲液，但不要让膜干燥，显影液要现用现配。

7、PVDF 膜上一抗二抗可以使用洗脱液洗脱，重新孵育一抗二抗。

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