THP-1细胞的培养方法和注意事项

简介：

THP-1细胞是从急性单核细胞白血病患者外周血中分离出来的单核细胞，广泛应用于单核细胞和巨噬细胞相关机制、信号通路等研究；形态和分化特性类似于原代单核细胞和巨噬细胞，在体外，常用PMA（phorbol 12-肉豆酸酯13-乙酸酯）或1α，25(OH)2D3 (1α，25-二羟基维生素D3或vD3)诱导分化THP-1细胞为巨噬细胞。因此，THP-1单核细胞已被开发为体外极化单核细胞来源的巨噬细胞的有吸引力的模型。

原理：

一、THP-1细胞的培养方法

1.细胞复苏

准备工作：15/50mL的离心管，马克笔，培养瓶（T25）/培养皿（直径60mm），RPMI 1640培养基，胎牛血清（FBS），双抗（PS），酒精瓶（消毒杀菌）+酒精棉球，离心管/试剂管架子，移液枪，tip头（1000/200ul）。

（1）首先用酒精棉球擦拭细胞房的实验台子，将我们所需要上述物品放入台子里，并用紫外照30min，此时打开水浴锅42℃。

（2）照完紫外后，将保存在-80℃或者液氮中的细胞拿出用一次手套包住并迅速放入42℃水浴锅中，一般在1min中内解冻。

（3）通过传递箱将细胞拿进细胞房，打开照明，打开细胞台子的玻璃门，用酒精喷洒手和细胞冻存管将细胞拿进台子里，进行细胞复苏。

（4）配置培养基：以50ml离心管为例：RPMI 1640培养基+10% 胎牛血清+ 1%双抗：500ul双抗（PS）+5mL(10%)/7.5(15%)胎牛血清（FBS）+RPMI 1640培养基加至50mL，并做好标记（培养基成分+配置时间+个人标记（名字））。

（5）首先准备一只15ml离心管，将细胞冻存管内的细胞以及冻存液吸取至离心管中，加入2mL 步骤（4）中配置好的RPMI 1640培养基，700~800rpm ，低速离心5min。

（6）离心的时间，准备T25培养瓶或者直径60mm的培养皿做好标记（细胞名称+复苏时间+姓名）。离心完成后，弃上清，吸取1ml（血清）细胞培养基重悬细胞。

（7）吸取2-3ml新鲜培养基至准备好培养瓶或者培养皿中，再将1ml细胞重悬液吸取至T25瓶或培养皿，“十字"摇匀细胞。

（8）用酒精喷洒后，将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中培养2-3天观察细胞状态。

注意：细胞在偏酸性环境中生长更快，当培养基稍微变黄（呈橘红色）时，比较适合细胞生长。

2、细胞传代

THP-1细胞为悬浮细胞且具有低密度依赖性，一般超过10^6/ml传代，比例一般为1:3/1:4，因此目前利用的两种传代方式：

(1)半换液传代（不用离心）:吸取培养瓶或者培养皿中的细胞移至新的培养瓶或者培养皿中，补足培养基2-3ml。

(2)传统的离心传代：将瓶子或皿中的细胞吸取至15mL离心管中，700-800rpm，离心5min；弃上清，吸取2-3ml新鲜培养基重悬细胞，分至新的培养瓶或者培养皿中并补足培养基2-3ml。

3、细胞冻存

（1）用10%DMSO：900ul FBS + 100ul DMSO （有毒小心操作）或直接用无血清细胞冻存液。

（2）收集生长状态较好的细胞于15 mL离心管中，一般细胞数目为5×10^6-10^7/ml，700-800 rpm离心5 min，在超净工作台中用枪头尽量去掉上清。

（3）加入1 mL冻存液，轻轻吹匀。将细胞放入梯度降温盒中，放入-80℃培养箱中几天后，转移至液氮中进行长期保存。

注意事项或培养方面的经验心得

（1）THP-1细胞冻存后复苏困难，因此要保证冻存的细胞数目足够5×10^5-10^6个cell/ml；否则细胞密度过低，复苏后状态不好。

（2）培养过程中如果存在细胞碎片，可等待细胞长起来后，通过低速离心去除。

（3）细胞发生少量聚团时我们可以等待THP-1细胞密度扩大后改善这种情况，但发生严重聚团时我们可以提高血清（FBS）用量，或者适度吹散细胞。

（4）THP-1细胞在传代后可能会出现贴壁现象，如轻微贴壁可以轻 吹收集细胞或者丢弃贴壁的细胞，贴壁较多时，可检查培养条件是否合适。

THP-1细胞培养过程中复苏困难、聚团问题分析

1、复苏困难

THP-1细胞对细胞密度具有高度依赖性。冻存时，密度一般为5×10^6-10^7/ml较为适宜；同时复苏密度也有依赖性，建议不低于3×10^6/ml。当细胞传过几次代，状态较好时，传代密度维持在5×10^/ml-10^6/ml较为合适，超过2×10^6/ml可进行传代。培养过程中如有细胞碎片，等细胞密度增大后可以通过低速离心去除。

2、细胞聚团严重

细胞聚团可能是细胞营养缺失或者受到损伤，所以共用了细胞膜，以便于彼此释放的促进生长的因子可以被很快接收到，细胞生长一段时间后，可吹打开，离心，然后换液。另外，THP1细胞离心速度一般不要高于800rpm，实验室常用600-700rpm，否则可能会导致细胞死亡。

（1）THP-1细胞在密度较稀时，有少量细胞聚团属于正常现象，我们需使用面积小的培养瓶（T25瓶）或者培养皿（直径60mm），培养基用量也相应减少，不建议将聚团的细胞吹散，等待密度高时，细胞会自然分散开。

（2）当细胞密度高时，聚团细胞比例高于30%时，聚团严重。细胞间界线不清晰，细胞团模糊且较大等现象，则这种细胞聚团是异常的。此时，若对细胞没有做过任何外界刺激或实验处理，可检查培养条件，一般更换优质血清或提高血清用量看是否有助于解决聚团问题。

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