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    PCR扩增没条带?关于PCR扩增的技巧总结

    发布时间: 2024-02-19  点击次数: 500次

    简介:

    首先,如果你已经设计了引物,PCR扩增没有条带,请这样做:

    使用第一次的PCR产物作为模版(1~2ul即可),再进行一次PCR。


    那你要重新学习PCR扩增了!这篇内容,涵盖了实验中可能遇到的PCR扩增问题和详细的解决办法,主要是如何培养问题解决问题的思考能力,你必须要知道!


    PCR扩增主要包括以下几个组分:1)引物;2)酶;3)dNTP;4)Buffer;5)CDNA或DNA。注:现今大部分PCR酶试剂盒一般都是酶,dNTP和Buffer的预混液。


    因此,需要从引物,酶,cDNA和DNA模版下手,进行分析。


    一共有以下三步:

    第一步,一定要确定的是-cDNA。

    每个基因在不同组织,不同时期中表达量是不同的。首先要确定你的基因在哪个组织,哪个时期表达最高,确认之后就选这些组织和时期,否则很难做出来。


    问题:怎么查找目的基因在哪个组织和时期中表达高?

    答:1)数据库。例如NCBI数据库。


    2)文章。查询你目的基因的别人做过的文章,看看他们使用的什么。


    3)新的基因,没有数据库记载,没有报道,什么都不知道。使用几种组织的混合的cDNA.


    第二步:检查你的酶

    酶的品质(主要是公司的工艺好不好),活性,保质期,buffer的冻融程度都会很大程度影响PCR扩增。因此,换一个酶是相对简单,必须试用的方法。


    第三步:最需要实验经验-引物设计

    解决了酶和cDNA的问题之后,需要进行最复杂的引物设计。引物设计是灵活的,根据目的的不同而不同。qPCR引物设计因为可以在序列上随机选择,因此可以使用引物设计引物进行设计,在这里我们主要详解基因克隆的引物设计,一般包括CDS的设计,基因区的设计,非编码区的设计等,这些片段的引物设计一般都固定在一段序列上,不能随意更改(GC含量,TM值都只能固定在一个相对范围内),因此需要一定的实验经验和理论基础,以下为详细的解决方法。


    1.GC含量低于40%或高于60%,长度不在18-25范围内,会出现引物二聚体,设计的引物不能遵循引物设计的原则怎么办?

    答:不是所有的引物都必须遵循引物设计的原则,也不是所有遵循引物设计设计原则的都可以扩增出来。例如:GC含量为65%,长度为28,如果实在设计不了符合原则的,可以以相对符合的设计方式进行,不必全部符合。


    2.设计了好几组引物,都不能扩增出来,怎么办?

    酶和cDNA都确定好之后,引物仍然扩不出来条带,对于不同的目的可以使用不同的方法。


    ①对于鉴定目的基因,只是想要确定这个基因的序列,可以这样做:


    在引物两端加一段碱基(5‘的序列可以自己设计),改变引物的GC含量,TM值等。


    ②对于仅需要扩增目的基因,不能在5’端添加碱基的情况,且使用F2/R2不能扩增出条带,可以这样做:


    先在CDS两端设计一对引物,先使用F1/R1进行扩增。然后再使用CDS引物F2/R2进行扩增。


    ③对于表达载体,需要扩增到载体上,可以这样做:

    1)先设计CDS区的引物F2/R2扩增,再使用这个PCR产物作为模版,使用带酶切位点(蓝色为酶切位点及保护碱基序列)的引物F1/R1进行扩增。


    2)改变所用的酶切位点。


    3)换连接方法。如果使用T4连接,可以换成同源重组的方法。


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