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    质粒构建的心得分享

    发布时间: 2024-02-20  点击次数: 190次

    质粒是我们日常实验中比较常用的载体,其可以自主生长,也能通过比较容易的方法进行大量扩增,但往往单一的质粒不能满足实验需求,需通过一系列方法进行质粒重组,我目前比较常用的方法也就是比较陈旧的酶切重组质粒的方式,简易实验过程如下图:

    1708396293214.png

    在这个过程中,有几个小Tips:

    1.原载体的酶切位点由文献、载体说明书或者导师建议得来,选择正确的酶切位点是重组质粒开始的第一步,常见的酶切体系如下:

    image.png

    上述体系适用于大多数酶切,不是特别难切开的载体1μl内切酶足够,酶切前计算好量,先加ddH2O,最后加内切酶。


    2.酶切完成后,需要跑琼脂糖胶鉴定酶切效果,配胶时注意选择合适的胶浓度,原则是分子量越大,胶浓度越小。跑胶完成后紫外灯下一般会有两段即为成功:载体和切下来的片段,根据结果进行胶回收,注意切下来的片段不回收,胶回收完成后测浓度备用。


    3.插入片段根据自己的实验选择,通常插入片段可以通过PCR而来,或者是一段由三方公司合成的序列,在连接开始前也需要用同样的两个内切酶切出缺口。常见连接体系如下:


    图片
    16℃连接4h以上或过夜。

    其中,加入载体和插入片段的量由说明书得来,加样前计算好量,先加ddH2O,最后加连接酶,由于连接体系较小,一般使用pcr管进行。

    4、为确保连接的顺利进行,务必保证连接酶和连接酶缓冲液配套使用,即使用同一厂家的,不能混用。

    5、上述过程中涉及到的不管是内切酶还是连接酶,都是比较昂贵的,使用时要用冰盒,用完及时放回-20℃冰箱。
    6、进行转化时,根据载体说明书选择合适的感受肽细胞,同时仔细阅读感受肽细胞说明书,看清涂板体积、涂板后的培养时间、培养温度等。
    7、挑取单克隆时,推荐至少选择两个及以上。
    8、摇菌时,注意拧松菌管的盖子,倾斜放入恒温(一般为37℃)摇床,摇菌时间12-16h为宜。
    9、摇菌完成后进行质粒提取,测浓度后送测序,注意这里会有部分说明书推荐选择新的内切酶酶切后跑琼脂糖胶进行鉴定,这也是一种鉴定方式,可以根据酶切片段的大小来判断重组是否正确,但是,最终确定还是推荐进行测序,因为我们无法保证在整个过程中碱基不会发生突变,可以根据上述方式选择酶切片段大小正确的质粒进行测序。

    测序的准确性对于后续慢病毒感染是非常重要的,因此测序公司的选择十分重要,尤其出现一些比较难测的结构如shRNA的发卡结构等,测序技术不成熟的话会一直报重叠峰或者测不通的情况。

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