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    Trizol法提取RNA:从样本前处理到操作步骤

    发布时间: 2024-02-28  点击次数: 146次

    一、实验原理:

    Trizol试剂的主要成分是苯酚,对细胞进行裂解,使细胞中的蛋白质以及核酸物质解聚。苯酚虽然可以有效的使蛋白质变性,但它不能全部抑制RNA酶的活性,因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(即RNA酶)。存放在Trizol 中的样品可以在负八十保存半年左右。


    二、样本材料及其处理方法:

    贴壁培养细胞

    1.吸出培养液,细胞用预冷的1×PBS清洗两次。2. 吸出PBS洗液,然后每1×108-2×107的培养细胞中加入1 ml的Trizol,轻摇培养皿,确保溶液均匀分布于细胞表面。(可用细胞刮刀剥离细胞)


    2.吸出PBS洗液,然后每1×108-2×107的培养细胞中加入1 ml的Trizol,轻摇培养皿,确保溶液均匀分布于细胞表面。(可用细胞刮刀剥离细胞)


    3. 使用移液器反复吹打使细胞脱落,然后将内含细胞的裂解液转移至离心管中,再用移液器吹打直至裂解液中无明显沉淀(溶液清亮)。


    4. 室温静置5-10分钟后,再进行后续的RNA提取操作。


    悬浮培养细胞

    1. 将悬浮细胞收集至离心管中,12000 rpm 4℃离心2分钟,弃上清,用预冷的1×PBS清洗两次。

    2. 向1×106-2×107细胞中加入1ml的Trizol。

    3. 用移液器吹打至裂解液清亮无明显沉淀。

    4. 室温静置5-10分钟后,再进行后续的RNA提取操作。


    动物组织、植物材料样品

    1. 将准确称取的RNA提取样品转移液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织(研磨过程中需要不断向研钵中补加液氮),直至研磨成粉末状,然后向粉末中加入适量的Trizol并混匀。(针对柔软易裂解的组织样本,可以使用匀浆器加入适量Trizol进行匀浆裂解。)


    2. 将上述混合液转移至离心管中,用移液器反复吹打充分混匀。室温静置5分钟,12,000 rpm 4℃离心5-10分钟。


    3. 小心吸取上清液,移入新的离心管中,再进行后续的RNA提取操作。


    三、操作步骤:

    (1)样本前处理

    (2)向上述裂解液中加入Trizol体积量1/5氯仿,充分混合(涡旋或用枪头混匀)。室温静置15分钟。

    (3)12000 rpm 4℃离心15分钟。小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,即:上清液(含RNA)、中间蛋白层及下层有机相。吸取上清液转移至另新的离心管中。

    注:每管大概取 200-300 μl,此步骤非常关键,提出的RNA质量好纯度高即可。若吸取水相时吸到有机相会导致双峰,A260/230特别低。

    (4)沉淀 RNA:向其中加入相同体积异丙醇,上下颠倒混匀。在-20℃放置10 min。12000 rpm 4℃离心10 min后弃去上清。

    (5)清洗 RNA:向沉淀中加入500 μl 预冷的无水乙醇,吹散沉淀洗涤RNA,洗涤两次,12000 rpm 4℃离心后弃去上清。

    注:把沉淀弹起来,让其悬浮在酒精中,然后放1-2min,让酒精充分接触沉淀,充分溶解有机试剂,然后再离心。

    (6)打开离心管,室温干燥沉淀约5分钟。

    注:不要离心干燥,否则RNA将很难溶解,如果残留乙醇较多可延长干燥时间。

    (7)向离心管中加入20 μl DPEC水溶解RNA。将溶解后的RNA放入-80℃保存。

    注:如果提取的是组织样本,溶解液可以多加点。

    (8)取2 μl进行电泳。

    四、注意事项:

    1. 防止RNA酶污染。

    • 戴好口罩,手套。
    • 全程最好在生物安全柜操作(根据实验条件)
    • 实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保RNase-Free。耗材均需要通过DPEC处理。

    2. 明确目标。

    • 提取成功标准是RNA的质量和纯度,而不是得率。

    3. 测量结果:

    • A260/A280:1.8-2.2,若<1.8则表明有蛋白质污染;

    • A260/A230:1.5-2.4,若<1.5则表明有明显的有机物如糖、肤、苯酚的污染。

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