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    琼脂糖凝胶电泳的常见问题&分析

    发布时间: 2024-02-29  点击次数: 221次
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    (一)同样大小的DNA一起跑电泳,怎么条带不一样大?

    DNA条带不一样大,本质上是DNA在凝胶中的迁移率不一样,有的跑得快,有的慢,通常情况同样大小的DNA,迁移率是一样的,条带位置也会一样。

    但迁移率也受很多因素影响,例如DNA的构象。例如环状超螺旋结构的DNA,和同等大小的线性DNA(例如单位点酶切后的质粒),前者的迁移率要高,表现出来就是看上去超螺旋结构的DNA分子量好像小一点。

    (二)为什么有时候加大电泳的电压,DNA会跑得快,但有时效果却不明显?

    在较低电压时,提高电压,DNA的迁移率也会提高;但如果DNA分子量太大时,增加电压后对DNA迁移率的提高其实不成比例,说白一点,就是有效果,但不明显。

    例如,当DNA分子量大于2Kb后,施加在电泳槽两端的电压不应该高于5V/cm,如果电泳槽长40cm,那么电压不应该高于200V。

    (三)琼脂糖质量对电泳效果有多大影响?

    有时候,换了一个批次的琼脂糖,或者更换了新的供应商的琼脂糖后,同样的样品进行电泳,效果也会有差异。

    最常见的一个原因在于,琼脂糖本身的质量也是影响电泳结果的一个因素。

    琼脂糖由大量的多糖组成,这些多糖会与硫酸盐吸附,成为一种叫硫酸化多糖的东西。在电泳时,它会产生正电荷,并向阴极移动,也就是和DNA移动的方向相反。

    最终,DNA移动的阻力就增加了。这种现象叫做琼脂糖的电内渗(EEO)。因此,采购低水平电内渗的琼脂糖能有效提高分离效果。

    (四)电泳缓冲液对电泳效果有多大影响?

    电泳时,电泳缓冲液是一种经常需要更换的试剂。

    最佳的状态,应该是,使用同一批次的电泳缓冲液母液进行1X电泳缓冲液的配置和对应档次电泳的凝胶配置。因为只有这样操作,才能保证整个离子缓冲环境是一致的。

    有时我们会为了图方便,长期使用一个批次的1X电泳缓冲液进行实验,甚至到了母液都用完了,还在用之前那个批次的缓冲液进行实验。这样就会影响实验效果了。

    另外,常见的电泳缓冲液的使用错误,还包括,直接倒入自来水替代电泳缓冲液,或者直接使用10X或50X的母液当缓冲液进行电泳。‘

    前者因为缓冲体系内缺乏足够的离子,造成电导率很低,DNA迁移速度很慢,甚至是静止了;而后者则因为电导率太高,造成整个缓冲液产热太厉害,甚至连凝胶都融化了。

    (五)低熔点琼脂糖和普通琼脂糖有什么区别?有什么用途?

    制作琼脂糖的原料通常是两种海藻:Gelidium和Gracilaria。普通的琼脂糖通常可以分离1~25Kb范围的DNA片段,熔化温度一般在85~90摄氏度,凝固温度一般在40~42摄氏度。

    对普通琼脂糖进行固化剂1号修饰后,可以降低琼脂糖的熔化温度。有的熔化温度甚至低至40~45摄氏度!

    这么低的熔化温度有什么意义和应用呢?答案是低熔点琼脂糖主要应用于DNA的快速回收,想象一下,在比较低的温度时,例如50~60摄氏度,低熔点的凝胶已经熔化了,但这个温度下DNA还是很稳定,不会解链的。

    因此,只需要进行简单的处理和升温就能实现DNA的回收,而且这种回收得到的DNA还能直接进行一些下游实验,例如细菌转化。

    (六)电泳缓冲液就是TAE buffer嘛?还有其他嘛?有什么区别?

    其实,琼脂糖电泳缓冲液有几种,分别是TAE、TBE和TPE,不过常用的一般是TAE。下面就来看看这三种缓冲液有什么区别。

    相同点:大家都是为电泳提供一个离子缓冲环境。

    不同点:组份不同,对应的缓冲能力不同,应用场景也略有不同。我们具体来看看。

    TAE:Tris-乙酸盐+EDTA缓冲液组成;缓冲能力最弱,如果长时间的电泳,则不适合。其中一个标志是长时间电泳后,凝胶的阳极一侧会发生酸化,凝胶中的溴酚蓝会从蓝色变为黄色。因此,TAE需要定期更换,才能保证电泳效果。

    TBE: Tris-硼酸盐+EDTA缓冲液组成;TPE:Tris-磷酸盐+EDTA缓冲液组成;缓冲能力比TAE要高,DNA在后两种缓冲液中的迁移速度较慢,适用于分离低分子量DNA的电泳实验。

    (七)上样缓冲液是什么?有什么用?

    在正式电泳开始之前,常使用上样缓冲液(loading buffer)来与样品DNA混合,这种缓冲液在电泳时有什么用呢?

    Loading buffer在琼脂糖凝胶电泳中的作用主要有三个:

    01 它可以增加样品的密度,确保DNA样品可以均匀沉入上样孔内;

    02 Loading buffer含有颜色指示剂,除了帮助上样时观察样品是否准确加入孔内

    03 这种颜色指示剂主要由溴酚蓝和二甲苯蓝FF组成,它们两者在电泳中会按照固定的迁移速度移动,所以,我们还可以在电泳时通过Loading buffer帮助我们观察条带的迁移进度

    (八)电泳条带看起来像个微笑的表情是什么原因?

    最常见的原因是因为上样量太大了,常见的凝胶孔位的宽度是5mm,如果往里面加载的样品超过0.5ug的话,就表明过量了。

    最后,电泳时就会出现条带两侧卷起弯曲(像微笑表情)、模糊不清、条带拖尾的现象。DNA片段越大,这种现象会越明显。

    需要补充的一点是,并不是所有出现条带拖尾的现象,都代表样品量过载,也有可能是含有其他杂质或样品降解造成的。

    (九)点样孔内出现很亮的条带,且不动,是什么原因?

    DNA分子在电压的推动下,会向前移动,但如果其分子量非常大,体积也就会变得很大,以至于无法穿过琼脂糖向前移动。


    如果在基因组DNA提取后,样本中含有蛋白质,那么就很可能出现这种现象。其原因在于基因组中有大量的组蛋白和DNA缠绕在一起,如果提取过程中去除不干净,这些蛋白就会和DNA一起进入后续电泳中。


    而蛋白在琼脂糖电泳中,无疑是体积超标了,因此整个孔内的DNA也无法移动出去。


    以下,我们还整理了一些过往制作的关于琼脂糖凝胶电泳的视频,有的是实验原理,有的是实验操作,希望对你有帮助。

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