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    人血浆IgG分离、纯化实验

    发布时间: 2024-03-06  点击次数: 302次

    一、实验原理

    IgG是免疫球蛋白的主要成分之一,也是动物和人体血浆的重要成分。血浆蛋白质成分多而复杂,要从血浆中分离出IgG,首先要尽可能除去其他蛋白质成分,使IgG在样品中比例大为增高,然后再纯化而获得IgG。


    硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用广泛。DEAE-纤维素(Diethylaminoethyl-cellulose,DEAE)是在纤维素上引入二乙基氨基乙基,属于弱碱型阴离子交换剂。吸附蛋白质的最适pH范围为7~9,pH超过9.5,DEAE基团则不解离带电荷。每克DEAE含0.96~1.24mmol/L可解离基团,与蛋白质的交换量可75-122mg/100mgDEAE。应用离子交换剂来纯化物质,是把要纯化的物质成分交换吸附于离子交换剂上,然后再分别洗脱下来获得纯品,或者把不需要的成分吸附于离子交换剂上,需要的成分直接流出,得到纯品。


    本实验采用DEAE-纤维素层析柱纯化血清IgG,利用pH6.7的缓冲液溶解样品IgG,此时IgG粗物中除IgG外,其他杂蛋白均带上不同数量的负电荷,可以和DEAE上的阴离子发生交换吸附于柱上。IgG因不解离带电,而不发生交换吸附,利用此特点,让溶解后的样品流过DEAE纤维素柱,即可直接收集到较纯的IgG。


    二、实验方法和步骤

    1.取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。


    2.3000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。


    3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。


    4.3000r/min离心20min,弃上清。


    5.于沉淀中加20 ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10 ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30 min。


    6.3000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。用10 ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。


    7.透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24 h,中间换液数次。


    8.以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 (取3~4 ml透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4 存在),直至无SO42-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。


    9.离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。


    10.过DEAE-纤维素层析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS(0.03 mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。


    三、注意事项

    1.一般不选用去离子水作为透析液,因为当选用去离子水时,透析袋内外达到渗透平衡时,因透析袋内蛋白质浓度很高,集聚了大量的负电荷,会产生很大的渗透压。通常选用低浓度的缓冲液作为渗透压。


    2.透析袋在出厂时,一般使用10%甘油处理过,因此可能含有极微量的重金属,硫化物等对蛋白质有害的杂志。使用前可将透析袋建成10~20cm每段,在2%的碳酸氢钠和1mmol/L的EDTA混合液中煮沸10min,并用蒸馏水全部洗净,存放于4℃,使用前需先灌满水,指压检查不漏,方可装样,留有三分之一至一半的空间,以防透析袋涨破。


    3.透析过程中每隔2小时换一次透析液,共操作3次后,第四次更换透析液,保持过夜,第二天早上即可得到纯化样品。


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