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    TRIzol提取细胞RNA的经验分享

    发布时间: 2024-03-26  点击次数: 216次

    一、TRIzol法提取RNA的原理

    Trizol是一种广泛适用于多种样品总RNA提取的试剂,例如人、动物、植物和细菌、血液等。一般提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染,常用于RT-qPCR、mRNA纯化等实验。


    广谱型Trizol含有异硫氰酸胍/酚,具有裂解能力,可在短时间内裂解细胞和组织样本并有效抑制RNase酶活性从而保证RNA的完整性。其原理是Trizol中异硫氰酸胍、苯酚等不可逆地使蛋白质和RNase变性。随后进行离心。在酸性条件下,总RNA保留在上层水相中,而大部分DNA和蛋白质保留在中间相或下层有机相中。然后通过用异丙醇沉淀回收总RNA。


    在这个过程中,可利用吡咯碳酸二乙酯(DEPC)可灭活RNase酶,75%的酒精洗涤RNA沉淀,去除蛋白质,相关有机物的污染;最后用无核酶水溶解白色沉淀得到所需RNA。值得注意的是TRizol有毒,需在通风橱内操作,做好自我防护!!


    二、实验步骤
    以细胞6孔板为例:

    通常情况下,6孔板一般种100万/孔细胞左右,对于TRIZOL法而言,该细胞数目已经足够,但对于新手而言,该数目提取的RNA浓度可能较低,因此我一般做浓度梯度或者时间梯度实为了保证RNA足够后续实验要求,因此我会再6孔板里面铺200万/孔细胞或者用6cm的中皿铺300万细胞。
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    图1. 六孔板(孔内细胞经过处理,浑浊程度不同)
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    图2. 6cm培养皿

    (1)对于细胞铺板:一般情况下我会收集10cm的皿4个或者5个T25培养瓶,一般情况下细胞生长较好可能会有3000-4000万的细胞,多的有5000万(悬浮细胞)。以悬浮细胞为例,浆细胞收集至15ml离心管后,离心去上清,再用1-2ml新鲜培养基重悬细胞,通常会用1ml重悬。根据传统的细胞计数板估计细胞数目:


    ①将计数板和盖玻片擦干净,通常用酒精喷洗几次,将盖玻片盖在计数板上

    ②此时我们会对细胞重悬液进行稀释,一般稀释10-20倍(20ul细胞悬液+180细胞培养基/20ul+380ul)

    ③计数板四个大方格细胞总数,压线细胞计左不计右,按照公式:细胞数/ml:4个大格子细胞总数/4 ×稀释倍数
    例如:细胞重悬为2ml,稀释20倍,铺6孔板,每孔大约200万个细胞则:四个大方格计数分别为36,38,39,48,则平均数为40.25,细胞数目为40.25×20×10^4即大约有805万个细胞/ml。
    铺6孔板大约需要1200万个细胞/2ml,则将取样误差计算在内:1200/805≈1.5,最终取1.51ml=1510ul细胞加新鲜培养基至12.1ml,验证:(1.51×805)/12.1≈100万细胞左右,每孔取2ml。

    (2)言归正传,目前使用RNA裂解液(TRIZOL)提取RNA:需要自备无核酶水(DEPC水),异丙醇,氯仿(目前一般用氯仿替代物),无水乙醇。主要注意事项是:保证无酶环境,在通风橱内操作!
    1)贴壁细胞:先用PBS清洗细胞1~2次,六孔板对照组和实验组内各加1mlRNA裂解液或0.5ml覆盖细胞,吹打细胞使其裂解,并将细胞+RNA提取液转移至1.5mlEP管中(无酶),做好标记,室温静置5min左右;

    2) 向上述裂解液中加入1/5RNA裂解液体积的氯仿200ul(1ml)/100ul(0.5ml),盖紧管盖,剧烈振荡15s左右,使两者充分混合,呈现乳浊状(RNA裂解呈粉红色),室温静置5min。
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    3)12000×g 4℃离心15min,样品分层:上层无色液体,中间层乳白絮状沉淀(尽量不要吸取到,可能会导致基因组DNA的污染),下层粉红色有机相,小心吸取上层无色液体至新的无酶EP管中,通常情况下,取小于RNA裂解液体积的60%约为500ul/200ul。
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    4)在新的EP管中加入等体积的异丙醇,上下颠倒混匀,室温放置10min;
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    5)2000×g 4℃离心10min,去上清,出现白色胶状沉淀即RNA;

    6)现配现用75%的乙醇(15ml离心管:11.25ml无水乙醇+3.75mlDEPC水/无RNase-free水),加入1.5ml离心管中,轻轻将沉淀弹起洗涤沉淀,7500g× 4℃。一般洗两次。

    7)室温晾干5min左右,一般没有被挥发的液体为无核酶水。最后加入30-50ul(一般加入30ul),溶解沉淀。放置-80保存以供后续使用。
    三、注意事项
    1、上述步骤为常规提取RNA的步骤,前提是我们的细胞量足够,否则整个过程可能就非常考验“信念感"(很可能在异丙醇沉淀RNA这一步骤未有白色沉淀出现):

    (1)做过:6孔板每孔铺100万细胞,3孔并提最终RNA浓度可达1000多ng/ul,目前200万每孔RNA浓度稳定在300-500ng/ul(六孔板细胞铺板数目有限);

    (2)步骤3)中吸取水相时,尽可能大小移液枪交替使用,例如取500ul,可使用200ul、100ul、50ul等体积多次吸取,尽量不要吸取到中间的絮状沉淀。

    2、异丙醇沉淀RNA这一步很关键,在我们离心后吸取丢弃上清时,在这一步之前我们有必要记住离心管放置的位置,例如离心管盖子方向统一朝外,根据离心方向,我们可以有选择吸弃上清,如下图所示。
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    图3. 离心管摆放位置
    3、值得注意的是75%的酒精现配现用,浓度过低洗涤不佳,还会导致RNA溶解,事实上第二次洗涤沉淀时我们也可以使用100%酒精,离心转速7500×g或不更换转速12000×g也可,洗涤次数不能偷懒,洗涤不干净可能会造成后期RNA浓度测定时蛋白质污染。

    4、室温晾干RNA沉淀时,可以倒扣离心管在滤纸上或者放在通风橱内,放置时间不宜过长,时间过长会导致RNA不易溶解。

    5、最后,在异丙醇沉淀RNA这一步骤中,如果看不见沉淀或者看不清沉淀,一种方法是我们可以使用手机手电筒或者mini小手电照射离心管管壁,可能会有微小的白色附着物,或者如第3点中所说的记住离心管的摆放位置,大小移液枪更换小心吸弃异丙醇。之后按步骤来可能仍会提出RNA。

    6、另外,TRIZOL法提取RNA可将细胞收集至离心管中即步骤(1)完成后,可将含细胞的RNA裂解液于-80冰箱保存保存月余。

    7、通常为了节约试剂,减少用量,0.5ml的TRIZOL足够RNA的提取。


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