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    CHO-K1仓鼠卵巢细胞株的培养方法

    发布时间: 2024-04-10  点击次数: 185次

    中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞是第一个被美国FDA、欧盟EMA和中国CFDA认可的用于生物制药领域的生产细胞,已广泛应用于各种治疗性蛋白质药物的大规模制备,包括重组抗体、重组单体蛋白质以及重组融合蛋白质等。CHO-K1是未经改造的野生型CHO细胞。最原始的CHO-K1细胞是贴壁培养,并需要添加血清,由于血清的批间稳定性问题,及后来病毒安全性问题,无血清悬浮培养成为趋势。实验室常以贴壁的CHO K1细胞构建稳转细胞株。

     

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    细胞形态:长梭形(10×倍镜)
    培养条件:DMEM/F12培养基,胎牛血清终浓度为10%
    培养温度:37°C

    细胞复苏:


    1.在摄氏37度的水浴中轻轻搅动,为防止受到污染,不要把O形环和盖子放在外面。解冻应迅速(约2分钟)。
    2.解冻后把冻存管尽快从水中拿出来,用75% 乙醇浸泡或喷洒消毒乙醇。从现在开始所有的操作都应该进行在严格的无菌条件下进行。
    3.将细胞悬液转移到含有9 ml(血清)细胞培养基的离心管中,10000 rpm离心5分钟。
    4.弃上清,用(血清)细胞培养基重悬细胞,转移至T25细胞培养瓶中。
    注意:在T25瓶加入细胞之前,可以先将包含(血清)细胞培养基的容器放入培养箱内至少15分钟,以便培养基达到正常PH(7.0至7.6)。
    5.将培养瓶转移至37℃,5% CO2培养箱中培养。


    细胞传代:


    1.弃去培养基,用PBS冲洗两遍细胞层,以消除所有痕量的血清
    2.加入2.0 ~ 3.0 mL  0.25%(w/v)胰蛋白酶溶液消化细胞,在倒置显微镜下观察细胞直到细胞层分散。
    注意:为了避免结块,请不要通过击打或摇晃瓶子。可在37℃培养箱等待细胞,加快细胞分散的速度。
    3.加入6 - 8 mL的(血清)细胞培养基终止消化并反复吹打,转移至离心管,1000 rpm 5 min。
    注意:(血清)细胞培养基里有血清,血清里过量的血清蛋白与胰酶结合,竞争性抑制,使胰酶无法继续消化细胞。
    4.  弃上清,添加新的培养基重悬细胞,向培养瓶/培养皿中添加适当的细胞悬浮液,并补充新鲜(血清)细胞培养基。
    5. 将培养瓶转移至37℃,5% CO2培养箱中培养。
    注意:ATCC建议传代比例为:1:4至1:8。


    细胞冻存:


    1.当细胞处于对数生长期时,可进行细胞冻存。
    注意:常见的细胞冻存密度是1-10*10^6 cells/mL。
    2.弃去培养基,用PBS冲洗两遍细胞层,以消除所有痕量的血清和细胞生长过程中产生的废料。
    3.加入2.0 ~ 3.0 mL 0.25%(w/v)胰蛋白酶溶液消化细胞,在倒置显微镜下观察细胞直到细胞层分散。
    4.加入适量的(血清)细胞培养基终止消化,枪头反复吹打混匀后将细胞悬液转移至离心管,1000 rpm 5 min。
    5.弃上清,依次加入700 μL培养基,200 μL胎牛血清重悬细胞,最后添加 10% DMSO 后梯度降温冻存。

    注意:DMSO加到细胞里会迅速放热,对细胞活力造成损伤,因此可以选择在最后一步添加,加完迅速转移至低温。

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