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CHO-K1仓鼠卵巢细胞株的培养方法
发布时间： 2024-04-10 点击次数： 74次中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞是第一个被美国FDA、欧盟EMA和中国CFDA认可的用于生物制药领域的生产细胞，已广泛应用于各种治疗性蛋白质药物的大规模制备，包括重组抗体、重组单体蛋白质以及重组融合蛋白质等。CHO-K1是未经改造的野生型CHO细胞。最原始的CHO-K1细胞是贴壁培养，并需要添加血清，由于血清的批间稳定性问题，及后来病毒安全性问题，无血清悬浮培养成为趋势。实验室常以贴壁的CHO K1细胞构建稳转细胞株。
细胞形态：长梭形（10×倍镜） 培养条件：DMEM/F12培养基，胎牛血清终浓度为10% 培养温度：37°C 细胞复苏： 1.在摄氏37度的水浴中轻轻搅动，为防止受到污染，不要把O形环和盖子放在外面。解冻应迅速（约2分钟）。 2.解冻后把冻存管尽快从水中拿出来，用75% 乙醇浸泡或喷洒消毒乙醇。从现在开始所有的操作都应该进行在严格的无菌条件下进行。 3.将细胞悬液转移到含有9 ml（血清）细胞培养基的离心管中，10000 rpm离心5分钟。 4.弃上清，用（血清）细胞培养基重悬细胞，转移至T25细胞培养瓶中。 注意：在T25瓶加入细胞之前，可以先将包含（血清）细胞培养基的容器放入培养箱内至少15分钟，以便培养基达到正常PH（7.0至7.6）。 5.将培养瓶转移至37℃，5% CO2培养箱中培养。 细胞传代： 1.弃去培养基，用PBS冲洗两遍细胞层，以消除所有痕量的血清。 2.加入2.0 ~ 3.0 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶溶液消化细胞，在倒置显微镜下观察细胞直到细胞层分散。 注意：为了避免结块，请不要通过击打或摇晃瓶子。可在37℃培养箱等待细胞，加快细胞分散的速度。 3.加入6 - 8 mL的（血清）细胞培养基终止消化并反复吹打，转移至离心管，1000 rpm 5 min。 注意：（血清）细胞培养基里有血清，血清里过量的血清蛋白与胰酶结合，竞争性抑制，使胰酶无法继续消化细胞。 4. 弃上清，添加新的培养基重悬细胞，向培养瓶/培养皿中添加适当的细胞悬浮液，并补充新鲜（血清）细胞培养基。 5. 将培养瓶转移至37℃，5% CO2培养箱中培养。 注意：ATCC建议传代比例为：1:4至1:8。 细胞冻存： 1.当细胞处于对数生长期时，可进行细胞冻存。 注意：常见的细胞冻存密度是1-10*10^6 cells/mL。 2.弃去培养基，用PBS冲洗两遍细胞层，以消除所有痕量的血清和细胞生长过程中产生的废料。 3.加入2.0 ~ 3.0 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶溶液消化细胞，在倒置显微镜下观察细胞直到细胞层分散。 4.加入适量的（血清）细胞培养基终止消化，枪头反复吹打混匀后将细胞悬液转移至离心管，1000 rpm 5 min。 5.弃上清，依次加入700 μL培养基，200 μL胎牛血清重悬细胞，最后添加 10% DMSO 后梯度降温冻存。 注意：DMSO加到细胞里会迅速放热，对细胞活力造成损伤，因此可以选择在最后一步添加，加完迅速转移至低温。
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