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    miRNA的逆转录和荧光定量PCR

    发布时间: 2024-05-07  点击次数: 64次

    microRNA(miRNA)是一种长度约为19-25nt单链RNA,一般参与转录后调节基因表达。作为非编码RNA(ncRNA),目前大量的研究显示一些差异表达miRNA在众多的疾病中扮演着重要的角色,而了解miRNA差异表达,荧光定量PCR是最基础、应用最多的检测和定量miRNA的方法。


    由于miRNA的长度比较短,因此传统的荧光定量并不适用,下面介绍的两种方法的最根本的原理其实就是延长miRNA.因此在这里分享了关于miRNA进行qPCR的两种方法和一些经验总结:


    一、提取细胞、血清或外泌体RNA

    就目前而言,针对不同样品TRIZOL法提取RNA是比较通用的提取RNA的试剂,但是也具有相应的提取试剂盒(血清RNA提取试剂盒),目前一般均使用的是TRIZOL法提取的total RNA进行后续实验,但有文献说明TRIZOL法可能会导致miRNA丢失,也可选择miRNA提取试剂盒。


    二、miRNA的qPCR

    1.miRNA茎环法逆转录 + miRNA荧光定量PCR

    原理:在逆转录过程中我们需要设计一个茎环引物与我们miRNA序列结合起到延长miRNA的作用。而茎环引物是一个长度约为45bp且能够自身环化的引物。每一个miRNA都具有自己特异的茎环引物。这最重要的原因就是设计的茎环引物中包含一段与miRNA互补序列有关:茎环逆转录引物 =5’端的茎环序列+3’端的miRNA的特定互补序列。


    ①茎环引物的设计:

    首先我们在miRBase数据库中查询到miRNA的成熟序列(5’-3’),利用excel中的替换功能将序列中的U全部换成T,一般地通用的茎环引物序列如CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC3’ 或者5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC3’,红色部分的序列可形成自身环化。

    另外,针对特定miRNA设计的茎环引物:只需要在通用茎环引物3’端加上miRNA的成熟序列中的U更换成T后的序列3’端开始数6-8个碱基(一般选择6个)的反向互补序列加在茎环通用序列的3’端即可,这样就得到某个miRNA的茎环引物。

    以hsa-miR-30b-5p为例,其成熟序列为UGUAAACAUCCUACACUCAGCU,U全部换成T:TGTAAACATCCTACACTCAGCT;则其茎环引物为:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′

    ②逆转录(RT):去除基因组DNA + 逆转录(可使用miRNA专用的茎环法逆转录试剂盒)

    1)去基因组DNA(2ul基因组去除试剂);

    2)RNA体积:根据提取RNA浓度来定+free-RNase H2O(to 10ul);

    3)吹打混匀,42度反应2min;

    4)逆转录:1ul茎环引物(stem-loop)+试剂盒中逆转录MIX(2ul+2ul)+free-RNase H2O(5ul)(to 20 ul)

    5)一般来说,一次逆转录只能进行一个miRNA的单独逆转录,但是根据实际情况而言,我们可以将miRNA+内参U6混合在一管中一同逆转成cDNA。

    根据以上试剂盒设计的加样量,我尝试过一管内混合逆转录内参+5个miRNA,其中主要的变化就是在第一步增大所加入RNA的量,在第二步加茎环引物时,我们可以将所加入的free-RNase H2O(5ul)替换成不同的茎环引物(5个),这种方式在特异性的基础上又比较高效的合成多个miRNA,虽然节省试剂,但是也存在弊端,例如我们加入Mix(包含酶或dNTP等)都是一定量的,加入过多的茎环引物合成最终的各种miRNA的cDNA产物可能存在浓度过低,混合不匀可能会影响后续的荧光定量。

    ③荧光定量(qPCR)

    1)荧光定量引物的设计:由于茎环引物存在一段通用序列,因此使用的反向引物(下游引物)一般也是通用的且试剂盒会配备有,此时我们只要设计特异的正向引物(上游引物),在遵循引物设计原则(长度18-26bp;GC含量:40%-60%;Tm:55-60℃)的基础上,正向引物=自身成熟序列去除茎环引物中的6个碱基5’-3’端剩下的碱基:正向引物:TGTAAACATCCTACAC,但是一般我们会对引物进行调整,与下游引物的Tm值相适应,调整荧光定量PCR的引物长度在5’端增加碱基C/G。茎环序列为:


    5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′,则通用反向引物为:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

    2)荧光定量:10ul体系(20ul体系减半)(SYBR染料法):

    5ulSYBR+1ulcDNA+2ulfree-RNase H2O+2ul正反引物(提前混合)

    例如:RT-qPCR分析hsa-miR-30b-5p的差异表达水平,以U6为内参:

    对照组+处理组:此时为了减小误差bar的大小做4个复孔,以八联管为例:

    miRNA的逆转录和荧光定量PCR

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