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    琼脂糖凝胶电泳的实验步骤及常见问题分析

    发布时间: 2024-05-07  点击次数: 73次

    实验原理:

    琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。


    DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。


    DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。


    实验步骤:

    1. 配胶 首先根据DNA片段大小确定琼脂糖凝胶浓度,称取相应质量的琼脂糖粉末于TAE/TBE缓冲液中溶解,微波加热1min左右取出(时间根据体积改变),加入Gelred染料,摇晃均匀后倒入模具。

    注:缓冲液为三乙酰-乙二胺四乙酸(EDTA)(TAE)或三硼酸-EDTA(TBE),三酸溶液是微碱性条件下的有效缓冲液,可保持DNA去质子化并溶于水。EDTA是一种螯合剂,能使可能损害被分析的DNA的核酸酶失活。

    表1 DNA片段大小与琼脂糖凝胶浓度的关系

    琼脂糖凝胶电泳的实验步骤及常见问题分析

    2、凝胶浇注

    选择所需尺寸的凝胶浇注模具和梳齿。轻柔地将加了染料的琼脂糖凝胶溶液倒入模具中,观察有无气泡产生,在胶未全部凝固的时候戳破,否则会影响最终结果。注:速度不可太快,否则容易出现气泡。

    3、将样品与DNA loading buffer混合

    将样品与含溴酚蓝的loading buffer混合,loading buffer可以帮助我们观察样品的位置。

    4、凝胶装入

    待胶变硬,直到呈乳白色且不透明(约20-30 min),小心地垂直拔出梳齿,将胶块放入电泳槽中,确保孔位于负电极(一般为黑色),将运行缓冲液(TAE或TBE)注入槽中,使凝胶被淹没1-2 mm。用移液器向泳道中加样,不要超过泳道载量,否则样品会溢出。

    5、凝胶运行

    确保电极没有插反,否则样品会跑到缓冲液中。设定凝胶运行的时间和电压,调节电压至4-5V/cm,DNA从负极移到正极,电泳时间30-60 min,具体根据凝胶比例和片段大小进行调整(一般120V,35 min即可)。电泳结束后,拔掉电源。

    常见问题分析:

    1.加样孔有荧光

    (1)提DNA时有蛋白质残留。

    (2)基因组DNA,如果使用普通的琼脂糖电泳,往往不能电泳出孔,滞留在加样孔中产生荧光。

    2.条带扭曲呈波浪状

    (1)配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。

    (2)电泳时电压过高。可以在电泳前15分钟用较低电压(3 V/cm),等条带出孔后,再调电压。

    (3)慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。

    3.条带弥散

    (1)DNA发生降解。

    (2)电泳缓冲液陈旧(根据DNA Maker对照,观察是否为电泳体系的问题)。

    (3)PCR过程产生非特异性的扩增 (使用特异性较高的引物)。

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