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    PCR引物设计原则

    发布时间: 2024-05-23  点击次数: 111次

    1、引物长度一般在15-30bp

    引物长度一般为15-30bp,常用的为18-27bp,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74°C,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;


    2、引物GC含量一般为40%-60%

    引物GC含量一般为40%-60%,以45-55%为宜,GC含量为高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;


    3、引物所对应的模版序列的Tm值最好在72°C左右

    Tm值在72°C左右可使复性条件最佳,至少要在55-80°C之间。Tm值在72°C左右可使复性条件最佳,至少要在55-80°C之间。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighboor method);


    4、引物3'端的碱基一般不用A

    引物3'端的碱基一般不用A,因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。


    5、引物3'端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。


    6、引物3'端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。


    7、如扩增编码区域,引物3'端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第三位易发生简并,会影响扩增特异性与效率;


    8、引物5'端可以修饰

    引物5'端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。


    9、碱基要随机分布,且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

    引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3'端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Cross Dimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致引物二聚体带的产生,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。


    10、引物的AG值最好呈正弦曲线形状,即3'端AG值较低,而5'端和中间ΔG值相对较高。AG值(自由能)反应了引物与模板结合的强弱程度,一般情况下,引物的AG值最好呈正弦曲线形状,即3端AG值较低,而5端和中间AG值相对较高。3'端的AG值相对要低,且绝对值不要超过9引物的3'端的AG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。


    11、引物应在核酸保守区内设计并具有特异性。引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。


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