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    慢病毒制备和导入细胞的操作步骤及注意事项

    发布时间: 2024-06-06  点击次数: 66次

    前置知识

    通过病毒介导将核酸导入哺乳动物细胞是一种常用的实验技术,被广泛用于基因传递、基因表达和功能研究等领域。这个实验通常分为以下6个部分:


    1.选择适当的病毒载体:常用的病毒载体包括腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)和逆转录病毒(Retrovirus)。


    2. 构建表达载体:将目标核酸(例如基因、RNA等)插入到病毒载体的适当位点上,构建表达载体。这通常涉及将目标核酸序列克隆到适当的表达载体质粒中,并进行验证和测序。


    3. 病毒包装和扩增:将构建好的表达载体转染到特定的包装细胞中,这些细胞能够产生具有完整病毒基因组的病毒颗粒。病毒颗粒可以通过细胞培养和病毒扩增过程进行大规模生产。


    4.细胞转染:将目标哺乳动物细胞培养在培养皿或培养板中,然后将病毒颗粒加入培养基中与细胞进行共培养。病毒颗粒会与细胞表面的受体结合,并进入细胞内部。


    5.核酸导入和表达:一旦病毒进入细胞内部,它会释放出核酸负链,该负链会被细胞核内的转录和翻译机制利用。目标核酸的表达产物(例如蛋白质)会在细胞内合成,并根据实验需要发挥其功能。


    6.实验分析:根据实验目的,可以对细胞和表达产物进行进一步的分析。这可能包括检测蛋白质表达水平、功能研究、细胞行为观察等。


    操作步骤

    A 慢病毒制备:

    1、提前一周复苏293T细胞,使用10% FBS-DMEM培养基传代3次以上。


    转染前一天将生长状态良好的293T细胞用0.25%胰酶消化,得到细胞悬液,计数,然后进行慢病毒质粒转染,稀释到10个/mL;

    将293T接种到6孔板(每孔接种2 mL),使其密度为40%。

    待其生长到孔板面积80-90%进行转染。

    2、通过质粒大提获得无内毒素质粒。

    3、在1.5mLEP管中分别加入150μL DMEM培养基、15μL lipofectamine 2000。

    4、在1.5 mL EP 管中分别加入700μL DMEM培养基、7μg目的DNA、5.25μg的psPAX2、1.75μg的pCMV-VSVG(使三条质粒质量比为 4:3:1)。

    5、将等体积的质粒混合物加入到转染试剂混合物中,室温静置5min。

    6、将隔夜培养的6孔板中培养基小心吸出,替换为新鲜DMEM(血清)细胞培养基。每个孔中加入300 μL的DNA-lipo 2000复合物。

    7、分别在转染后24h、48h,收集六孔板中病毒上清液,经0.45μm的滤膜过滤或离心去除细胞碎片(短期内可放于4℃保存,长期保存于-80℃冰箱,勿反复冻融)。

    B 慢病毒感染:

    1、提前一周复苏靶细胞,传代三次以上保证细胞生长状态良好。病毒感染前一天将靶细胞传代到6孔板,使细胞生长密度为约20%。

    2、待细胞生长至孔板面积50-60%时,加入2ml病毒液,加入polybrene,并补加0.5ml(血清)细胞培养基,恒温培养24h。

    3、用(血清)细胞培养基更换病毒液,恒温培养24h。

    4、加入适量的抗生素筛选,每次换液时补加抗生素,至靶细胞细胞无明显死亡。

    注意事项:

    1.选择合适的载体和元件:根据实验需要选择适当的质粒载体和启动子,例如CMV启动子、SV40启动子等。

    2. 细胞状态和转染密度:细胞状态好,且处于指数生长阶段。靶细胞密度不宜过高或过低,建议将细胞密度控制在指数期的70-80%;

    3. 选择合适转染试剂、比例和转染时间:选择适当的转染试剂,不同类型的细胞和外源DNA可能需要使用不同的试剂进行转染;

    同时,还需要对慢病毒质粒、DNA和转染试剂的比例、转染时间进行优化。可在感染靶细胞时加入适量的聚凝胺提高转染效率。

    4.抗生素浓度:可在转染前做MTT实验探究其工作浓度,选取合适的筛选浓度使转染的细胞能够存活并形成稳定的细胞系。

    5.筛选时间:在进行稳定转染实验时,需要进行足够长的筛选时间以检测出稳定转染的细胞系,转染后可通过WB,流式细胞术,Dot blot等方法验证。


    6.对照组设置:设置阳性和阴性对照以评估转染效果和筛选是否成功。


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