慢病毒制备和导入细胞的操作步骤及注意事项

前置知识

通过病毒介导将核酸导入哺乳动物细胞是一种常用的实验技术，被广泛用于基因传递、基因表达和功能研究等领域。这个实验通常分为以下6个部分：

1.选择适当的病毒载体：常用的病毒载体包括腺病毒（Adenovirus）、腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）和逆转录病毒（Retrovirus）。

2. 构建表达载体：将目标核酸（例如基因、RNA等）插入到病毒载体的适当位点上，构建表达载体。这通常涉及将目标核酸序列克隆到适当的表达载体质粒中，并进行验证和测序。

3. 病毒包装和扩增：将构建好的表达载体转染到特定的包装细胞中，这些细胞能够产生具有完整病毒基因组的病毒颗粒。病毒颗粒可以通过细胞培养和病毒扩增过程进行大规模生产。

4.细胞转染：将目标哺乳动物细胞培养在培养皿或培养板中，然后将病毒颗粒加入培养基中与细胞进行共培养。病毒颗粒会与细胞表面的受体结合，并进入细胞内部。

5.核酸导入和表达：一旦病毒进入细胞内部，它会释放出核酸负链，该负链会被细胞核内的转录和翻译机制利用。目标核酸的表达产物（例如蛋白质）会在细胞内合成，并根据实验需要发挥其功能。

6.实验分析：根据实验目的，可以对细胞和表达产物进行进一步的分析。这可能包括检测蛋白质表达水平、功能研究、细胞行为观察等。

操作步骤

A 慢病毒制备：

1、提前一周复苏293T细胞，使用10% FBS-DMEM培养基传代3次以上。

转染前一天将生长状态良好的293T细胞用0.25%胰酶消化，得到细胞悬液，计数，然后进行慢病毒质粒转染，稀释到10个/mL；

将293T接种到6孔板（每孔接种2 mL），使其密度为40%。

待其生长到孔板面积80-90%进行转染。

2、通过质粒大提获得无内毒素质粒。

3、在1.5mLEP管中分别加入150μL DMEM培养基、15μL lipofectamine 2000。

4、在1.5 mL EP 管中分别加入700μL DMEM培养基、7μg目的DNA、5.25μg的psPAX2、1.75μg的pCMV-VSVG（使三条质粒质量比为 4:3:1）。

5、将等体积的质粒混合物加入到转染试剂混合物中，室温静置5min。

6、将隔夜培养的6孔板中培养基小心吸出，替换为新鲜DMEM（血清）细胞培养基。每个孔中加入300 μL的DNA-lipo 2000复合物。

7、分别在转染后24h、48h，收集六孔板中病毒上清液，经0.45μm的滤膜过滤或离心去除细胞碎片（短期内可放于4℃保存，长期保存于-80℃冰箱，勿反复冻融）。

B 慢病毒感染：

1、提前一周复苏靶细胞，传代三次以上保证细胞生长状态良好。病毒感染前一天将靶细胞传代到6孔板，使细胞生长密度为约20%。

2、待细胞生长至孔板面积50-60%时，加入2ml病毒液，加入polybrene,并补加0.5ml（血清）细胞培养基，恒温培养24h。

3、用（血清）细胞培养基更换病毒液，恒温培养24h。

4、加入适量的抗生素筛选，每次换液时补加抗生素，至靶细胞细胞无明显死亡。

注意事项：

1.选择合适的载体和元件：根据实验需要选择适当的质粒载体和启动子，例如CMV启动子、SV40启动子等。

2. 细胞状态和转染密度：细胞状态好，且处于指数生长阶段。靶细胞密度不宜过高或过低，建议将细胞密度控制在指数期的70-80%；

3. 选择合适转染试剂、比例和转染时间：选择适当的转染试剂，不同类型的细胞和外源DNA可能需要使用不同的试剂进行转染；

同时，还需要对慢病毒质粒、DNA和转染试剂的比例、转染时间进行优化。可在感染靶细胞时加入适量的聚凝胺提高转染效率。

4.抗生素浓度：可在转染前做MTT实验探究其工作浓度，选取合适的筛选浓度使转染的细胞能够存活并形成稳定的细胞系。

5.筛选时间：在进行稳定转染实验时，需要进行足够长的筛选时间以检测出稳定转染的细胞系，转染后可通过WB，流式细胞术，Dot blot等方法验证。

6．对照组设置：设置阳性和阴性对照以评估转染效果和筛选是否成功。

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