质粒图谱

质粒图谱为质粒DNA序列的物理图谱，提供了包括质粒的大小、筛选标记、克隆位点、转录及翻译元件等信息，为我们选择质粒、了解质粒特点及应用提供了重 要依据。对于初学者来说该如何去阅读质粒图谱呢？今天来给大家讲解一下如何阅读质粒图谱及构建质粒图谱。

质粒的组成要素有哪些

1. 复制起始位点：Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
   

2. 抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+。

3. 多克隆位点MCS：克隆携带外源基因片段。

4. P/E 启动子/增强子

5. Terms 终止信号

6. 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用

如何阅读质粒图谱

第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）。

第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。

1.Ampr 水解 β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

2.tetr 可以阻止四环素进入细胞。

3.camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

4.neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418（卡那霉素衍生物衍生物）失活。

5.hygr 使潮霉素 β 失活。

第三步：看多克隆位点（MCS）。

它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。

质粒一般只能容纳小于 10 Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。

这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用哪种载体，还是要以实验目的为准绳。

启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号

启动子－促进 DNA 转录的 DNA 顺序，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。

增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。

核糖体结合位点/起始密码/ SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。

转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。

第六步：质粒图谱上的箭头。

 有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。

质粒构建以及需要注意的事项：

1.载体构建

 载体构建(vectorconstruction)：载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。主要包括已有载体多克隆位点（MCS）的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。是为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。

 特点：当给质粒插入一段外源DNA片段后，它依然能够进行自我复制。

2.多克隆位点

 多克隆位点（multiple cloning site, MCS），指的是包含数个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头（polylinker），是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。MCS上含有多个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位，每个限制性酶切位点通常是十分奇特的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。不同酶的酶切位点可有重叠。单一酶切位点就是只有一种特定的酶能够识别并进行酶切的位点，多克隆位点一般是位于质粒上的一段序列，这段序列含有很多个酶切位点，但这些酶切位点每一个都被一种酶识别并酶切。

3.质粒构建

（1）质粒构建原理

质粒构建是分子生物学研究中经常使用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

（2）质粒构建方式

质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，下面就介绍下T4连接酶构建质粒方法，T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接，但一般推荐适用黏性末端。

（3）质粒载体的制备

质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

图 质粒图谱

4.一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：

   （1）选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切；

    （2）一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：

目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）。

（3）实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。

（4）尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。

（5）两个酶切点至少隔上3个碱基。

（6）两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

（7）最好使用酶切效率高的酶。

（8）最好使用双酶切有共同buffer的酶。

注：质粒构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。

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