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    质粒图谱

    发布时间: 2024-06-24  点击次数: 357次

    质粒图谱为质粒DNA序列的物理图谱,提供了包括质粒的大小、筛选标记、克隆位点、转录及翻译元件等信息,为我们选择质粒、了解质粒特点及应用提供了重 要依据。对于初学者来说该如何去阅读质粒图谱呢?今天来给大家讲解一下如何阅读质粒图谱及构建质粒图谱。


    质粒的组成要素有哪些

    1. 复制起始位点:Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。

    2. 抗生素抗性基因:可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+。

    3. 多克隆位点MCS:克隆携带外源基因片段。

    4. P/E 启动子/增强子

    5. Terms 终止信号

    6. 加poly(A)信号:可以起到稳定mRNA作用

    质粒图谱


    如何阅读质粒图谱

    第一步:首先看 Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)。

    第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。

    1.Ampr 水解 β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。

    2.tetr 可以阻止四环素进入细胞。

    3.camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。

    4.neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418(卡那霉素衍生物衍生物)失活。

    5.hygr 使潮霉素 β 失活。

    第三步:看多克隆位点(MCS)。

    它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

    第四步:再看外源DNA插入片段大小。

    质粒一般只能容纳小于 10 Kb 的外源 DNA 片段。一般来说,外源 DNA 片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。

    第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。

    这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用哪种载体,还是要以实验目的为准绳。

    启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号

    启动子-促进 DNA 转录的 DNA 顺序,这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。

    增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。

    核糖体结合位点/起始密码/ SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是 AUG(起始密码)和 SD 序列。

    转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区,这 2 部分共同构成 poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区,这 2 部分共同构成 poly(A)加尾信号。


    第六步:质粒图谱上的箭头。

     有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条 DNA 链,即质粒是环状双链 DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上。


    质粒构建以及需要注意的事项:

    1.载体构建

     载体构建(vectorconstruction):载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。主要包括已有载体多克隆位点(MCS)的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。是为把DNA分子运送到受体细胞中去,必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid),在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。

     特点:当给质粒插入一段外源DNA片段后,它依然能够进行自我复制。


    2.多克隆位点

     多克隆位点(multiple cloning site, MCS),指的是包含数个(最多20个)限制性酶切位点(restriction site)的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头(polylinker),是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。MCS上含有多个单一酶切位点,是外源DNA的插入部位,每个限制性酶切位点通常是十分奇特的,即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。不同酶的酶切位点可有重叠。单一酶切位点就是只有一种特定的酶能够识别并进行酶切的位点,多克隆位点一般是位于质粒上的一段序列,这段序列含有很多个酶切位点,但这些酶切位点每一个都被一种酶识别并酶切。

     

    3.质粒构建

    (1)质粒构建原理


    质粒构建是分子生物学研究中经常使用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶,DNA连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。


    (2)质粒构建方式

    质粒构建方式多样,常规的T4连接酶,下面就介绍下T4连接酶构建质粒方法,T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接,但一般推荐适用黏性末端。


    (3)质粒载体的制备

    质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切,一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个,尽量使载体的末端具有特异性,防止自连。


    质粒图谱

    图 质粒图谱

    4.一般目的基因用于克隆表达的情况下,酶切位点的选择要考虑到:

       (1)选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小(>10bp),否则影响限制性内切酶对切点的识别,不利于空载体的双酶切;

        (2)一般目的基因用于克隆表达的情况下,酶切位点的选择要考虑到:

    目的基因片段内部不含有所选的酶切位点(不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断)。

    (3)实验后继应用的所有载体(真核、原核、酵母、昆虫)都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确(定向克隆)。(不然换载体表达时,还要重新设计引物,以引进新的酶切位点)。

    (4)尽可能选比较常用的酶切位点(常用切点酶的价格比较便宜)。

    (5)两个酶切点至少隔上3个碱基。

    (6)两个酶切点最好不要是同尾酶(切下来的残基不要互补),否则效果相当于单酶切。

    (7)最好使用酶切效率高的酶。

    (8)最好使用双酶切有共同buffer的酶。


    注:质粒构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。


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