销售热线

19126518388
  • 技术文章ARTICLE

    您当前的位置:首页 > 技术文章 > 实时荧光定量 PCR 操作流程及注意事项--RNA模板的制备

    实时荧光定量 PCR 操作流程及注意事项--RNA模板的制备

    发布时间: 2025-02-26  点击次数: 205次
    一、RNA模板的制备
    常见的RNA提取的方法:传统的酚CHCl₃抽提法和柱式抽提法。
    操作流程概要
    酚CHCl₃抽提法
    以 Vazyme 产品 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent (Vazyme #R401) 为例
    自备材料
    CHCl₃,异丙醇,75% 乙醇 (DEPC 水配制 ),DEPC 水
    组分
                                                                                                                                                                                                             
    样本制备(过多的样本量可能会导致样本裂解不充分,并使产物纯度降低;)
    1ml RNA is olater 能够充分裂解的最大样本量如下:                                                                                                                                                                                                                                                                  
    贴壁细胞(对于贴壁牢固的细胞可用细胞刮勺剥离细胞)
    1.弃培养液,PBS 洗涤一次。
    2.每 10 cm2 培养面积的细胞加入 1-3 ml RNA isolater,使之充分覆盖到细胞表面,
    然后用移液器将细胞吹打下来。
    3.将裂解液转移至 1.5 ml 离心管中,用移液器反复吹打直至无明显颗粒样存在。

    冰上静置 5 min


    悬浮细胞
    1、离心收集细胞,PBS 洗涤一次。
    2、每 5 ⅹ 106 -107 个细胞加入 1 ml RNA isolater。

    3、用移液器反复吹打直至无明显颗粒样存在。冰上静置 5 min。


    动物组织
    液氮研磨(部分研磨会影响 RNA 的得率和质量):
    1、将液氮研磨的粉末立即转移至离心管中,加入 RNA isolater 裂解液,静置。待样品全部融化后,再继续吹打至裂解液透明。
    2、将裂解液转移至离心管中,12,000 × g 4℃离心 5 min,吸取上清。
    匀浆处理:
    1、可将新鲜组织尽量剪碎浸泡在 RNA isolater 裂解液中,用电动匀浆器高速匀浆,将组织全部研磨均匀。
    2、将裂解液转移至离心管中,12,000 × g 4℃离心 5 min,吸取上清。

    提取流程        
    实时荧光定量 PCR 操作流程及注意事项--RNA模板的制备                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                    
    柱式抽提法

    以 Vazyme 产品 FastPureTM Cell/Tissue Total RNA Isolation Mini Kit (Vazyme #RC101/RC111) 为例


    自备材料
    组分
    β- 巯基乙醇、无水乙醇、RNase-free 枪头等。

    实时荧光定量 PCR 操作流程及注意事项--RNA模板的制备
    培养细胞
    贴壁细胞:

    无需消化,可直接使用 Buffer RL1( 已加入 β- 巯基乙醇 ) 进行消化、裂解;或用胰酶消化后离心收集细胞加入 Buffer RL1( 已加入 β- 巯基乙醇 ),每 2-5×106 个细胞加入 500 μl Buffer RL1。用移液器反复吹打混匀直至看不到细胞团块。(使用前在 Buffer RL1 加入 β- 巯基乙醇至终浓度为 1%(如1 ml Buffer RL1 中加入 10 μl β- 巯基乙醇),尽量现配现用)


    悬浮细胞:
    直接离心收集细胞,加入 Buffer RL1( 已加入 β- 巯基乙醇 ),每 2-5×106 个细胞加入 500 μl Buffer RL1,用移液器反复吹打混匀直至看不见细胞团块。(每 2-5×106 个细胞加入 500 μl Buffer RL1,细胞裂解完后若不立即进行下一步操作,可以置于 -70℃、保存)
    提取流程
    相关产品
    实时荧光定量 PCR 操作流程及注意事项--RNA模板的制备

    安培生物致力成为推动生命科学进步值得信赖的合作者

    深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技术实力、先进的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东,服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司,旨在为生命科学的发展提供较好的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线,在各个领域内向用户提供较高的水平和质量稳定的产品,安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等客户提供各种产品、技术支持与服务。可以在第一时间为用户提供比较先进的专业资讯和完备的产品和物流服务。 专业的技术力量使得我们能够为广大用户提供强大的技术支持,深厚的人脉资源使得我们在全国主要城市拥有众多的合作伙伴,安培生物非常荣幸能将世界上先进的高科技产品推荐给国内从事生物学领域科研的老师和同仁。作为专业性的产品供应商,公司出资存备了大量现货,配合优秀的销售队伍以及专业的技术支持,随时为客户提供服务



产品中心 Products