实时荧光定量 PCR 操作流程及注意事项--RNA模板的制备

常见的RNA提取的方法：传统的酚CHCl₃抽提法和柱式抽提法。

操作流程概要

酚CHCl₃抽提法

以 Vazyme 产品 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent (Vazyme #R401) 为例

自备材料

CHCl₃，异丙醇，75% 乙醇 (DEPC 水配制 )，DEPC 水

组分

                                                                                                                                                                                                         

样本制备（过多的样本量可能会导致样本裂解不充分，并使产物纯度降低；）

1ml RNA is olater 能够充分裂解的最大样本量如下：                                                                                                                                                                                                                                                                  

贴壁细胞（对于贴壁牢固的细胞可用细胞刮勺剥离细胞）

1.弃培养液，PBS 洗涤一次。

2.每 10 cm2 培养面积的细胞加入 1-3 ml RNA isolater，使之充分覆盖到细胞表面，

然后用移液器将细胞吹打下来。

3.将裂解液转移至 1.5 ml 离心管中，用移液器反复吹打直至无明显颗粒样存在。

冰上静置 5 min

悬浮细胞

1、离心收集细胞，PBS 洗涤一次。

2、每 5 ⅹ 106 -107 个细胞加入 1 ml RNA isolater。

3、用移液器反复吹打直至无明显颗粒样存在。冰上静置 5 min。

动物组织

液氮研磨（部分研磨会影响 RNA 的得率和质量）：

1、将液氮研磨的粉末立即转移至离心管中，加入 RNA isolater 裂解液，静置。待样品全部融化后，再继续吹打至裂解液透明。

2、将裂解液转移至离心管中，12,000 × g 4℃离心 5 min，吸取上清。

匀浆处理：

1、可将新鲜组织尽量剪碎浸泡在 RNA isolater 裂解液中，用电动匀浆器高速匀浆，将组织全部研磨均匀。

2、将裂解液转移至离心管中，12,000 × g 4℃离心 5 min，吸取上清。

提取流程        
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                   

柱式抽提法

以 Vazyme 产品 FastPureTM Cell/Tissue Total RNA Isolation Mini Kit (Vazyme #RC101/RC111) 为例

自备材料

组分

β- 巯基乙醇、无水乙醇、RNase-free 枪头等。

培养细胞

贴壁细胞：

无需消化，可直接使用 Buffer RL1( 已加入 β- 巯基乙醇 ) 进行消化、裂解；或用胰酶消化后离心收集细胞加入 Buffer RL1( 已加入 β- 巯基乙醇 )，每 2-5×106 个细胞加入 500 μl Buffer RL1。用移液器反复吹打混匀直至看不到细胞团块。（使用前在 Buffer RL1 加入 β- 巯基乙醇至终浓度为 1%（如1 ml Buffer RL1 中加入 10 μl β- 巯基乙醇），尽量现配现用）

悬浮细胞：

直接离心收集细胞，加入 Buffer RL1( 已加入 β- 巯基乙醇 )，每 2-5×106 个细胞加入 500 μl Buffer RL1，用移液器反复吹打混匀直至看不见细胞团块。（每 2-5×106 个细胞加入 500 μl Buffer RL1，细胞裂解完后若不立即进行下一步操作，可以置于 -70℃、保存）

提取流程

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