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    了解和认识胎牛血清,特殊加工工艺血清,您知道几种?

    发布时间: 2021-08-18  点击次数: 1132次

    血清作用原理:

    正因为血清来源于动物,含有细胞培养中所需的各种营养(血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等),所以奠定了血清是细胞培养实验中最基本普遍试剂的基础。血清通常用作细胞生长的添加物,拥有多种功能和用途,如:富含大分子蛋白,低分子量的营养素,作为氨基酸、碳水化合物、维生素的额外来源;提高介质的缓冲能力;可结合或中和有毒成分;减少细胞氧化应激,减少细胞凋亡;提供促进生长的因子,有助细胞适应环境。


    ▽ 成分表

    了解和认识胎牛血清,特殊加工工艺血清,您知道几种?



    血清通过牛龄进行分类,可大致分为:

    胎牛血清(Foetal Bovine Serum,简称FBS)、国产胎牛血清(并无明确定义,但通常用此命名)、新生牛血清(Newborn Calf Serum,简称NBCS,或称小牛血清)、成年牛血清(Adult Bovine Serum,简称ABS)。

    不同牛龄血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。


    ▽ 比较

    了解和认识胎牛血清,特殊加工工艺血清,您知道几种?



    一、透析胎牛血清

    常规细胞培养需要添加血清来维持细胞的增殖能力,尽管血清可以满足一般细胞培养需求,但在进行营养成分优化和标记特定成分进行研究的实验中,仍需要去除某些特定的成分,常用的去除方法有透析。透析是将血清循环通过中空纤维,并在血清中补充生理盐水以维持渗透压,移除分子量小于10,000Da的小分子,如氨基酸、葡萄糖、盐离子和未结合的蛋白等。
    因此透析胎牛血清主要用于关注小分子浓度的特殊研究,包括:研究蛋白质组学,同位素标记、细胞信号传导和报告基因分析、报告基因细胞系的筛选等。

    ①细胞培养条件下稳定同位素标记技术(简称SILAC)

    这是一项以质谱为基础的定量蛋白质组学技术,全称为Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC)。它将13C或15N标记的氨基酸掺入到培养基中培养细胞,来标记细胞内新合成的蛋白质,一般培养5-6代,细胞中的蛋白质将都被同位素标记。然后质谱分析,即可比较经过不同处理的细胞,其内部蛋白质丰度的变化。它还可用于正常细胞与病理状态细胞二者的比较。为避免胎牛血清中天然氨基酸的干扰,这时就需要用到透析胎牛血清,以保证掺入细胞蛋白中的氨基酸均为标记氨基酸(常采用赖氨酸或精氨酸)。

    ②工程细胞株的筛选

    以常见的工程细胞株CHO-DFGRˉ为例,该细胞自身缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR),必须在添加了次黄(嘌)漂呤、胸腺嘧啶和甘氨酸的培养液中才能得以存活。如将含有目的基因与DHFR基因的质粒转染细胞,则可以得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆。通过甲氨蝶呤(MTX)进一步筛选,可进一步得到能表达大量目的蛋白的细胞克隆。这时的胎牛血清由于不含有次黄(嘌)漂呤和胸腺嘧啶等,也常作为选择培养基的一部分,参与阳性转染细胞克隆的筛选。

    研究某些因子如核苷酸或微量元素如硒、锌对某种类型细胞增殖、分化的影响。这时也需要用透析胎牛血清,以避免培养体系中天然存在的这些物质的干扰。



    二、碳吸附胎牛血清

    在进行营养成分优化和标记特定成分进行研究的实验中,需要去除某些特定的背景成分,常用的去除方法有碳吸附,使用活性碳和右旋糖苷去除血清中的激素。

    活性炭能够结合脂溶性分子,通过碳吸附可降低血清中许多激素及生长因子的浓度,如雌二醇、皮质醇、皮质酮、孕酮、B类维生素、睾酮及T3、T4、前列腺素等。该血清适用于上述一些分子可能干扰实验结果的实验中,对于那些需要这些分子的细胞培养,也可能降低细胞生长性能。

    碳吸附胎牛血清用于体外培养,去除背景值以验证激素的作用效果,研究包括醇类受体连接,细胞受体类固醇调节,各种组织激素分泌和甲状腺激素功能。

    适用于:培养干细胞、原代细胞、神经细胞、人类癌细胞、人类骨髓细胞、白血病细胞、人类胚肺成纤维细胞、人类脑神经细胞和瘤细胞等细胞。



    三、去外泌体胎牛血清

    外泌体由分泌性细胞分泌,存在于所有的生物体液中,包括血液、尿液、唾液、乳汁和脑脊液中。它们随后被其他细胞吸收并发挥生物活性。


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    △外泌体


    胎牛血清中含有大量的外泌体,但在外泌体研究中,如果仍然使用胎牛血清培养细胞,并通过收集上清液来提取外泌体进行实验,那么胎牛血清中本身的牛源外泌体将会对实验分析造成极大的干扰。去外泌体血清是将由无菌采集的健康胎牛血清经过过滤,去除≥99%的胎牛血清内源外泌体,还可使细胞在培养时与未处理的胎牛血清具有相同的增殖速率和形态。

    因此,去外泌体血清主要用于细胞体外的增殖培养,收获目标细胞的外泌体。



    四、四环素调控系统胎牛血清

    普通胎牛血清中一般会含有四环素(Tet),当使用非常敏感的Tet-诱导的基因表达系统时,研究人员往往会遇到非预期的基因表达的问题,为了确保精确地基因表达,建议使用四环素调控系统胎牛血清,应用于使用敏感四环素诱导表达系统的细胞培养(Tet-on, Tet-off),以及其它对四环素敏感的实验中。



    五、低IgG胎牛血清

    IgG是胎牛血清中发现的最常见的抗体,低IgG血清主要通过A-Sepharose处理,使血清能够保留原有的生物活性,同时降低血清的IgG含量,低于5μg/ml。低IgG胎牛血清适用于培养杂交瘤细胞。
    因此,低IgG胎牛血清有利于单克隆抗体的纯化,用于研究抗体和病毒反应、细胞表面抗原表位。



    六、去脂胎牛血清

    去脂胎牛血清通过固体基质脱脂作用去除内源性脂类、甘油三酯和胆固醇,含量仅为标准胎牛血清的1/3。

    去脂胎牛血清在细胞培养中用量较多,其含有丰富的细胞生长必须的营养成分,常用于动物细胞的体外培养,具有极为重要的功能。

    ①提供对维持细胞指数生长的激素,基础培养基中没有或量很少的营养物以及主要的低分子营养物。

    ②提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调变它们所结合的物质活力。

    ③有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热源质结合,起到解毒作用。

    ④是细胞贴壁、铺展在塑料培养基上所需因子来源。

    ⑤起酸碱缓冲液作用。

    ⑥提供蛋白酶抑制剂,使在细胞传代时剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受伤害。

    去脂胎牛血清可用于蛋白激酶CK2-α’与腺样囊性癌肺转移相关性研究:

    ①蛋白激酶是酶类这个家族中最庞大的一员,被用来完成蛋白磷酸化作用的催化,这是控制细胞生命活动中最通常的机制。其中*有效性的蛋白激酶之一可能就是CK2。蛋白激酶CK2(protein kinase CK2, PKCK2),过去曾经被称为酪蛋白激酶-2或Ⅱ(cascin kinase2 or Ⅱ)。它是由两个催化亚基(aa’)和两个调节亚基(ββ)构成的不均一四聚体。

    ②蛋白激酶CK2是由两个分别为42—44KDa和38KDa的aa’ββ型异四聚体结构。该结构很稳定,在体外只有在变性的条件下才能被解离。除了细胞基质,一些病毒蛋白也被CK2所磷酸化。蛋白激酶CK2在转录、信号、增殖,并且在导致肿瘤发生的各细胞步骤中发挥作用。



    七、热灭活系列血清

    加热可以灭活补体系统。启动的补体系统参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,启动淋巴细胞和巨噬细胞活化。在免疫学研究中,培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。
    实验显示,热灭活血清对大多数的细胞而言是非必需的,对于非必须的细胞来说血清灭活对于细胞生长只有微小甚至无任何作用,还可能造成生长速率降低,沉淀物还会显著增多,不利于细胞观察。因此,若非必须,不需要对血清进行灭活处理。
    如若需要使用热灭活血清,可通过提高血清温度到56℃,并且保持该温度30分钟完成。建议加放空白对照(同体积水)使用温度计测温,以测得温度为56℃时为计时起始点,加热中可不时轻度旋转混匀血清。



    ☆ 血清的使用方法

    血清从冰冻区中取出后(切勿直接将血清从-20℃置入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀),放置于2℃~8℃中使之融化,解冻过程中间歇地轻轻摇晃均匀,待全部溶解后再分装或直接使用。完全融解的血清从4℃拿出,按要求比例(5%-20%)加基础培养基配置成完全培养基,建议使用不完时,置于4℃冰箱存放并于1-2周内用完。



    ☆ 使用血清时的注意事项

    血清沉淀的物质主要有:纤维蛋白(絮状沉淀),脂蛋白,冷凝集素,玻连蛋白,胎球蛋白,磷酸钙(显微镜下小黑点沉淀),胆固醇等。

    哪些原因容易导致血清沉淀:

    1、温度改变太大,血清由-20℃直接放入37℃解冻,因温度改变剧烈容易导致沉淀。

    2、血清在室温或4℃冰箱放置时间太久,血清中的不稳定成分会被破坏,影响细胞生长效果;导致血清品质变差,也会产生沉淀。

    3、血清分装冻存时,注意在不产生气泡的情况下摇晃均匀,避免因血清成分浓度改变产生沉淀。

    4、血清灭活后容易产生沉淀,如需使用灭活血清,请按56℃,30分钟,轻微摇晃原则操作,灭活温度过高、时间过长、摇晃不均都容易产生沉淀。

    5、如有血清沉淀,分装后进行离心处理,建议400g离心5分钟,取上清使用。



    结语:

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