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    【技术贴】DNA 纯化实验的几种常用方法

    发布时间: 2021-08-24  点击次数: 2945次

    DNA 纯化是分子生物学研究中经常需要用到的一种方法。一般来说,做DNA 纯化有3 个目的:1. 获得高纯度的DNA;2. 浓缩DNA;3. 用DNA做测序,芯片等生物信息学方面的实验。下面,谈一谈DNA纯化的几种常用方法。


    DNA 纯化实验基本上可以分为 PCR 清洁试剂盒纯化法DNA凝胶回收纯化法两大类。PCR 清洁试剂盒纯化法又称为硅胶膜吸附法。因为它的原理是:硅胶膜可在高盐条件下结合 DNA, 又可在低盐条件下与DNA分离。而 DNA 溶液中的其他渣渣包括引物、单核苷酸、酶、矿物油、盐离子等,因为没有 DNA 的这种神特性,所以会被分离开来。  


    如果你的 PCR 产物得到的是单一条带,完全可以直接纯化。那么问题来了。如果发现有杂带?怎么办?有哪些办法可以提取得更干净?



    那么就诞生了我们的第二种方法:DNA 凝胶回收纯化法。这种方法简单粗暴有效率,也能纯化得比较彻底。现在已经慢慢地取代了第一种方法,成为了DNA 纯化的主流方法。 扩增时出现非特异性条带,那么在胶回收时切胶很重要,切胶时尽量选择目的基因条带,可以将目的基因所在的胶的边缘弃去一些,尽量不要切上含有非特异性带的胶。切胶之后就是回收了,这里分享个小窍门,回收可以用酚氯仿


    PCR 产物经过酶切、回收等步骤后,损失太大。合适的做法是:简化步骤、减少核酸在处理过程中的损失,让较多量的 PCR 产物和质粒片断进入酶连反应——以量取胜。DNA 凝胶回收纯化法是很粗放型的,但是成功率很高。如果愿意,你可以试试。


    大致的做法是:制作 100 μL PCR 产物;酒精沉淀回收 PCR 产物;PCR 产物及载体酶切;跑回收胶;将回收胶上的 PCR 产物和载体片断切下,回收到一个试管中;冰冻、碎胶,酚、氯仿 抽提,酒精沉淀;加入8微升水、1 微升连接酶和 1 微升连接 buffer,4 度过夜;转化涂板。


    PCR 产物回收 

    1. 制备 100μL PCR 产物。 

    2. 将 100μL PCR 产物加入一 1.5mL 离心管中,再加入 400μL 双蒸水,颠倒混匀。加入 900μL  预冷无水乙醇、20μL3M 的醋酸钠。颠倒数次混匀。(提示 本方法使用的醋酸钠量较小,但足够沉淀核酸,并且无需洗盐。) 

    3. 4℃静置 30 分钟,以利于核酸沉淀。 

    4. 12000rpm 4℃ 离心 15 分钟,沉淀核酸。 

    5. 弃上清,将离心管倒置于干净吸水纸巾上 5 分钟。室温下吹风干燥。(提示 可将试管置于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集,可盖好管盖后,轻弹管底数次,将液体分散挂在管壁上,再打开管盖吹风。) 

    酶切直接在回收 PCR 产物的试管中配置酶切体系。1%琼脂糖回收胶回收(碎胶、酚氯仿抽提法)。 

    综上所述,纯化的主要目的就是要去除蛋白质。而酚氯仿混合液能有效地使蛋白质变性,同时抑制 RNAase 的活性,酚氯仿还可以减少酚在核酸溶液中的痕量。所以是一种好东西。


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