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    你真的了解 TA 克隆吗?

    发布时间: 2021-08-25  点击次数: 973次

    首先,TA 克隆是用于 PCR 产物的克隆和测序。原理是利用 Taq 酶能够在 PCR 产物的 3’末端 加上一个非模板依赖的 A,而 T 载体是一种带有 3’T 突出端的载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把 PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点中。 


    那么在你做 TA 克隆时,需要准备的前期工作是什么呢?


    1 、设计引物 P 出你的目的基因 

    不管你是手动设计还是软件设计或是直接引用别人已经发表文章用到的引物,只要能 P 出 来目的片段就行,在 PCR 的结果中需要注重 P 出来的浓度,要达到浓度高的要求一方面是在前期的样本准备本身就得到高浓度。 

    比如要 P 出一种病毒的某部分基因,那么在病毒的 RNA 提取时,就必须保证该病毒的病变效果明显,才有可能得到高浓度的 RNA,继而或者逆转录得到高浓度的 cDNA。

    另一方面是在 PCR 的条件时对于退火温度等的条件把握,如果有一些引物二聚体存在,那么可以尝试提高退火温度,延长一点延伸时间,但具体如何使得 PCR 跑出来又亮又单一,还是需要摸摸条件。


    2 、切胶回收产物 

    在紫外仪下切下目的产物,注意一定要快准狠,尽快切下,并尽可能少的切下多余的胶,回收利用的试剂盒一般严格按照试剂盒操作应该没有什么问题。回收之后测浓度,准备下一步。


    3 、连接 

    这一步骤就直接按照选择的 T 载体说明书来操作了,需要注意的是,在上一步测完回收浓度后,如果浓度较低,建议在试剂加量上尽量加大 DNA 的用量。 

    一般来说回收之后就赶紧地进行连接,但是由于有时候可能中间时间耽误了,没能及时连接, 那么在这之前可以补加两个步骤,一是加 A 尾,二是纯化回收的产物。 

    但是在长期的尝试中,我发现纯化与否和手动加 A 尾并不怎么影响连接效果。


    4 、转化铺板 

    这个步骤用来筛选重组子,长出来的菌多不是好事,菌少也不是坏事,也许就只长两个单克隆菌,但这两个都是阳性重组子,反正只要挑到正确的就行。


    5 、菌液 PCR 鉴定 

    一般挑菌之后在 EP 管中摇个 3 到 5 个小时就可以进行菌液 PCR 了,一般来说这样的摇菌时间能最保证接近真实的阳性结果,菌液 PCR 之前有人建议说要煮沸几分钟再 P,但其实直接取摇菌的 1ul 作为模板,进行 PCR 就可以了,条件与之前 P 产物的条件一致。


    6 、酶切鉴定 

    酶切位点的选择必须要确保目的基因中没有这个位点,而载体与目的基因连接附近有位点。在进行酶切的时候是要摸酶切时间的,是否已经切开跑一个电泳看看。


    7 、测序鉴定 

    如果实在是觉得上面两个鉴定都拿不准,那也可以尝试测序,如果测序结果与目的基因能够完全比对匹配上,那么也说明就是连接上了。


    其实 TA 克隆是非常简单的克隆,先天的条件 A 和 T 都已经具备了,除非你手实在不顺,连个 2500bp 以下的都是没什么问题的。

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