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    表达融合蛋白时,如何把两个基因拼接起来?

    发布时间: 2021-08-26  点击次数: 663次

    A君:我要表达一个 ras 加 GFP 融合蛋白,怎么设计引物?

    安培君:你的 GFP 标签蛋白在载体里还是要你自己插进去?

    A君:是我自己插进去。

    安培君:你打算怎样融合?

    A君:是不是这样?酶切 A 基因,酶切质粒,把 A 先插入载体,筛选出克隆,然后酶切 B 基因,用不同的酶酶切质粒,将 B 基因插入含 A 的载体。

    安培君:No,何必这么复杂,SOE PCR 吧!

    A君:什么是 SOE PCR?


    SOE PCR 是一种通过寡聚合甘酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行 PCR 扩增,从而获得目的 DNA 基因片段的方法。SOE PCR 可简单地凭借互补引物,通过 PCR 迅速地将两段 基因连接在一起,成为新的杂交基因片段。

    若要将基因 A 和 B 连接在一起,假设引物 P1、P2 扩增基因片段 A,引物 P3、P4 扩增基因片段 B;P2、P3 为内引物,P2 上含有 B 的序列,P3 上含有 A 片段的互补序列。单独 PCR 后, P1、P2 将 A 的 3'端带有 B 的 5'端的互补序列,P3、P4 将 B 的 5'端带有 B 的 3'端的互补序列;将各自 PCR 产物混合作为模板,变性退火后,A 链和 B 链结合起来,延伸成新的杂交基因,可以将 A、B 连接起来。

    下面以表达融合蛋白 S 和 A 为例,给大家介绍拼接基因 S 和基因 A 的方法,先在 NCBI 中 查找两个基因的 mRNA 序列,然后利用 primer6.0 软件,设计扩增基因 S 和 A 基因的引物, 并去除 S 的终止子和 A 基因的起始密码。


    关键问题来了,引物要怎么设计?SOE PCR 引物设计跟普通 PCR 引物有什么不同? 

    *SOE PCR 引物比较长,可长达 80bp,太短要增加反应次数,提高成本。(土豪可忽略) 

    *引物有重叠区域,引物间的 overlap region 以 25~30bp 为宜,尽量避免富含 AT 的序列。 

    *考虑引物的 TM 值,依照“50℃规则“可以设计出可行的重叠区,但也必须全面考虑其他引物的 Tm 值,在 PCR 的前 5 个循环中,采用就低引物 Tm 值设计退火温度是很好的解决办法。 

    *引物长,更要避免自身二级结构、引物二聚体形成等。 在 S 上游引物 5'端加入 EcoR V 限制性核酸内切酶位点,在其下游引物 5'端则加入 BamH I 限制性核酸内切酶位点、含 5 个氨基酸残基的柔性肽基因序列(linker 序列) 以及基因 A 的部分 5'端序列,在 A 基因的上游引物 5 端加入 BamH I、含 5 个氨基酸残基的柔性肽基因序列 (linker 序列)以及基因 S 的部分 3’端序列,在其下游则加入酶切位点 Not I 酶切位点。

    S (P1): 5'-ATAGATATC GGAGAA CGG GAT ATG TTT AG-3' 

    S (P2)5'- ATA GGATCC ACC GCC ACC GAC ATTGCC AAC GTA TTT TAAG- 3' 

    A (P3): 5'-ATA GGA TCC GGT GGC GGT GGC TCC GCT CAA GTA AT C AAC ACT-3' 

    A (P4): 5'-GCGGCCGC CGACAT CCTATC GACCTAAC-3'

    划线部分为酶切位点 

    接着以 S (P1)和 S (P2)为引物,含有 S 基因的 cDNA 为模板;以 A (P3)和 A (P4)为引物,含有 A 基因的 cDNA 为模板;进行 PCR,得到上述产物并鉴定后,将两者混合作为模板,以 S (P1)  和 A (P4)为引物扩增融合基因 S-A。采用两步法循环模式:第一步将两种模板混合后,在不加引物的情况下循环 3 次;第二步加上引物后,在循环 28 次。

    将产物转入载体进行后续的克隆。 引物的结构组成看上去虽然复杂,但设计起来却十分简单,无非就是在普通引物设计的基础上加上重叠区以及一些修饰: 

    *Gene S 5’端的修饰,gene A 3 ‘端的修饰,比如增加限制性酶切位点进行克隆和表达。 

    *Gene S 3’端的突变,gene A 5’端的突变,比如进行偏嗜密码子的修改、起始密码子的掺入。 

    *在 gene S 和 gene A 之间添加 DNA linker。


    在应用这一技术时,还有几个要注意的问题: 

    *DNA 酶的质量:应避免使用 Taq 酶,因其在 PCR 产物 3 端添加一个突出的 A,从而造成移码,翻译蛋白时全部错位,不好意思今天白忙活,去墙角哭会。因此,为了最大限度地避免碱基的错配,一般采用具有 3‘-5‘外切酶活性的高保真酶,如 TLI DNA Polymerase (Promege)、 KOD DNA Polymerase(Toyobo)、Pyrobest DNA Polymerase (Takara)。比起普通酶,这些高保真酶是贵了点,但真的物有所值。 

    *模板的来源: 在构建嵌合 ORF 时,如果选择基因组 DNA 为模板的话,可能会 P 出非翻译 区,宜选择 mRNA 作为原始模板。

    *接头序列(Linker):通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来, 使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链, 使得融合蛋白中的两种成分能分别形成正确的空间结构、 更好的发挥生物学活性。Linker 序列就像安排一个人畜无害的小伙伴在性格比较暴躁的两人之间,充当和平使者,避免冲突。 

    *Mg2+是 DNA 聚合酶活性的依赖离子,Mg2+浓度过低会影响聚合酶活性,过高会造成非特异扩增。SOE-PCR 中:在保证产物扩增效率及特异性的前提下,尽可能降低 Mg2+的浓度, 这可最大限度地提高 DNA 聚合酶的保真性。


    今天就分享到这,大家记得要好好消化一下!


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