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    【教程】构建载体其实一点也不难!

    发布时间: 2021-08-26  点击次数: 546次

    我们在研究基因的功能时,逃脱不掉的就是为了我们的实验目的,可能需要构建各种载体,比如表达载体,克隆载体,基因打靶载体等等。很多人在构建载体的时候都感觉很困难,特别是对于一个刚进入实验室的新人来说那更是难上加难,完全摸不着头脑。

    那是因为其实构建载体是一个不小的工作量,需要经历很多的过程,比如首先我们需要设计引物引入酶切位点,接下来还需要经历酶切酶连等过程,只要其中的某一环节出现问题,那最终都会导致实验失败。

    构建载体最关键的一步就是设计引物引入酶切位点,一旦引物设计好,那接下来就非常简单了,今天重点就来教教大家如何利用 snapgene 轻松获得构建载体所需的引物序列。 

    1. 打开软件,选择第一个(红线标记),然后输入基因的 CCDS 序列(基因的 CCDS 序列可在 NCBI 数据库中获得)


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    2. 点击 ok 后界面如下,图中显示的是会切割基因编码序列的酶


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    3. 接下来点击最上面的 Enzymes Noncutters,会显示所有不会切割基因编码序列的酶,这些酶都是我们可以用的,选酶的标准:要选择不能切割目的基因序列并且质粒上含有的酶,还有就是最好是实验室有的酶。

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    4. 确定了可以用的酶后,接下来需要确定设计引物时用的这两种酶,确定方法:这两种酶最好不要邻近,最好使用双酶切有共同 buffer 的酶,两个酶切位点最好不要是同尾酶(切下来的残基不要互补),否则效果相当于单酶切。 


    5. 确定了所要用的酶之后,接下来需要做的就是设计引物并引入酶切位点(注意:一定要看清楚载体上 promoter 的方向,将 CDS 正向插入到 promoter 后面) 


    6. 点击左下角的 sequence,然后拉取上游一部分基因本身的序列,拉取的时候会显示拉取的碱基的个数以及 Tm 值,拉取到 Tm 值 55 度左右就可以(55 度以上最好)

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    7. 然后点击 primer——add primer,选择 top strand


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    8. 点击 insertions,在 site 位置处选择你准备引入的酶,比如我要引入 EcoR I,那我就选择它,然后点击 insert,这样我们就引入了该酶的酶切位点。


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    9. 接下来需要添加保护碱基,一般所有的酶的保护碱基都加三个,加哪个碱基没有要求,使 GC 含量及 Tm 值适中即可。


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    10. 这样上游引物就设计好了,接下来需要检测一下引物是否会形成发卡结构,可以应用 OligoCalc,如果发现会形成发卡结构,那就需要对引物序列做出一些调整,直到发卡结构消失。 


    11. 接下来拉取基因的下游的一部分序列,用同样的方法设计好下游引物,有一点需要注意的是,设计下游引物的时候选择 bottom strand。 


    这样构建载体所需的引物就设计好了,怎么样,是不是感觉其实也没有那么难,接下来就可以构建属于你自己的载体了。

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